柞蚕Hemolin及其互作蛋白Yippee的免疫学功能研究

摘要

柞蚕（Antheraea pernyi）作为一种重要的野生经济昆虫，其丝可用于纺织工业，蛹和蛾可以作为食品和保健品而深受群众喜爱。研究柞蚕先天免疫防御机制对于增强柞蚕抗病能力，对提高柞蚕茧丝量及经济效益具有重要的理论和实际意义。
　　本研究克隆了柞蚕的Hemolin(Ap-Hemolin)和Yippee(Ap-Yippee)基因，并对其免疫学功能和相互作用机制进行了探讨。研究结果如下:
　　1.Ap-Hemolin和Ap-Yippee基因的克隆及原核表达。
　　根据已获得的部分基因序列设计引物，经过PCR扩增得到了Ap-Hemolin和Ap-Yippee基因序列。其中Ap-Hemolin基因序列全长1418bp，包括41bp5'端非编码区序列，1242bp的开放阅读框(ORF)以及135bp的3'端非编码区序列。系统进化分析显示Ap-Hemolin属于Hemolin家族，含有Hemolin保守性结构域。Ap-Yippee基因开放阅读框大小为366bp，编码121个氨基酸。Ap-Yippee属于Yippee-Mis18超家族，具有一个锌指结构域。
　　分别将Ap-Hemolin和Ap-Yippee的ORF构建入Pet-28a(+)表达载体进行原核表达，均得到了与预测分子量大小相符的重组蛋白。然后利用镍亲和柱进行重组蛋白的纯化，并制备兔多克隆抗体。为进一步验证Ap-Hemolin和Ap-Yippee的功能奠定了基础。
　　2.Ap-Hemolin和Ap-Yippee的时空表达分析。
　　检测了Ap-Hemolin和Ap-Yippee在五龄三天柞蚕幼虫不同组织中的表达情况。结果表明Ap-Hemolin和Ap-Yippee在几乎所有的组织中均有表达。Ap-Hemolin在血淋巴及脂肪体中表达水平较高，而Ap-Yippee在脂肪体和马氏管中表达水平较高。在时期表达特征分析中发现Ap-Hemolin基因在蛹期和蛾期表达明显高于其他其他时期，而Ap-Yippee基因则在蛹期和卵期表达较高。
　　3.Ap-Hemolin和Ap-Yippee之间的相互作用关系。
　　利用先前制备的Ap-Hemolin和Ap-Yippee多克隆抗体，采用Far-Western在体外进行了Ap-Hemolin和Ap-Yippee蛋白之间互作实验。结果表明柞蚕Ap-Hemolin和Ap-Yippee重组蛋白可以在体外相互结合。并通过RNAi技术分别沉默AP-Hemolin和AP-Yippee基因，发现在AP-Hemolin基因沉默后，AP-Yippee基因表达量降低，而AP-Yippee基因沉默后，AP-Hemolin基因的表达量也有所降低。说明二者之间确实存在着某种调控关系，但是其调控过程很可能有别的基因参与。
　　4.Ap-Hemolin和Ap-Yippee蛋白的免疫学功能分析。
　　采用柞蚕核多角体病毒(AP-NPV)、大肠杆菌（E.coli）、白僵菌（B.bassiana）对柞蚕五龄三天幼虫进行免疫刺激后分析检测Ap-Hemolin和Ap-Yippee在血淋巴及脂肪体中表达模式的差异。发现免疫刺激后Ap-Hemolin和Ap-Yippee在mRNA和蛋白水平上均有上调且在不同病原微生物刺激下表达模式也不尽相同，表明Ap-Hemolin和Ap-Yippee在柞蚕的免疫应答过程中具有重要作用。体外凝集试验发现，重组的Ap-Hemolin蛋白在体外依然具有活性并可以发挥对大肠杆菌的凝集作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．昆虫免疫概述

1．1 体液免疫

1．2 细胞免疫

2．Hemolin蛋白的研究进展

2．2 Hemolin的结构分析

2．3 Hemolin的免疫学功能

2．4 Hemolin与昆虫发育

2．5 Hemolin与蜕皮激素

3．Yippee蛋白的研究进展

3．1 Yippee蛋白的研究

3．2 Yippee的结构分析

3．3．Yippee的功能分析

第二章 引言

2．1 研究目的与意义

2．2 研究内容与技术路线

2．2．1 研究内容

2．2．2 技术路线

第三章 柞蚕Hemolin及Yippee基因的克隆与特征分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验动物与主要实验仪器

3．1．2 cDNA模板与RACE模板的制备

3．1．3 PCR引物设计，柞蚕Hemolin及Yippee基因cDNA的扩增

3．1．4 柞蚕Hemolin及Yippee基因PCR产物的克隆与测序

3．1．5 柞蚕Hemolin及Yippee基因的生物信息学及进化分析

3．2 实验结果

3．2．1 柞蚕脂肪体RNA的提取

3．2．2 柞蚕Hemolin与Yippee基因序列的分析

3．2．3 Hemolin与Yippee的多重序列比对与系统进化树分析

3．3．讨论

3．4．结论

第四章 柞蚕Hemolin和Yippee的原核表达及抗体制备

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试验仪器与试剂

4．1．2 常用溶液配制

4．1．3 柞蚕Hemolin和Yippee基因原核表达载体的构建

4．1．4 柞蚕Hemolin和Yippee重组蛋白的表达及验证

4．1．5 柞蚕Hemolin和Yippee重组蛋白的可溶性分析

4．1．6 柞蚕Hemolin和Yippee重组蛋白的纯化

4．1．7 柞蚕Hemolin和Yippee蛋白的抗体制备

4．2 实验结果

4．2．1 柞蚕Hemolin及Yippee蛋白的小量诱导及Western blot验证

4．2．2 柞蚕Hemolin及Yippee蛋白的纯化及抗体制备

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 柞蚕Hemolin和Yippee相互作用关系的研究

5．1 材料与方法

5．1．1 主要实验仪器

5．1．2 柞蚕Hemolin和Yippee的基因克隆

5．1．3 柞蚕Hemolin和Yippee蛋白的表达与纯化

5．1．4 柞蚕Hemolin和Yippee包涵体蛋白的复性

5．1．5 柞蚕Hemolin与Yippee蛋白的互作实验

5．1．6 柞蚕Hemolin和Yippee的RNA干扰实验

5．2 实验结果

5．2．2 柞蚕Hemolin与Yippee蛋白互作结果

5．2．3 柞蚕Hemolin和Yippee RNA干扰结果

5．3 讨论

第六章 柞蚕Hemolin和Yippee的免疫功能研究

6．1 实验动物和主要实验仪器

6．1．2 柞蚕的分组处理

6．1．3 主要实验仪器

6．1．4 常用试剂配置

6．2 实验方法

6．2．1 病原微生物的处理

6．2．2 柞蚕的处理

6．2．3 柞蚕的解剖及组织处理

6．2．4 柞蚕组织RNA的提取与质量检测

6．2．6 荧光定量PCR

6．2．7 数据统计与误差分析

6．2．8 柞蚕组织蛋白的提取

6．2．9 Western blot检测

6．2．10 柞蚕Hemolin蛋白的体外凝集实验

6．3 实验结果

6．3．1 柞蚕Hemolin和Yippee在组织中的分布研究

6．3．2 柞蚕Hemolin和Yippee在不同发育阶段的表达差异研究

6．3．3 免疫刺激柞蚕后Hemolin的表达模式分析

6．3．4 免疫刺激柞蚕后Yippee的表达模式分析

6．3．5 柞蚕Hemolin蛋白对大肠杆菌的体外凝集实验

6．4 讨论

6．5 结论

结论

1．克隆得到柞蚕Hemolin和Yippee的基因序列

2．成功获得柞蚕Hemolin和Yippee重组蛋白并制备了多克隆抗体

3．验证了柞蚕Hemolin和Yippee蛋白的体外互作与调控关系

4．Hemolin和Yippee参与柞蚕对病原微生物的免疫反应

参考文献

个人简介

在读期间发表的论文及专利