稻粒黑粉病、稻曲病病原真菌快速检测方法研究

摘要

稻粒黑粉病是由Tilletia horrida Tak.引起的一种至使水稻穗部发病的真菌性病害。近年来，随着杂交水稻的大力推广和杂交稻制种量的明显提高，稻粒黑粉病的发生日益严重，尤其是杂交水稻的制种田受害最为严重，该病害逐渐成为水稻的主要真菌病害之一。严重影响杂交水稻种子的品质和制种产量。对种子带菌进行严格病原菌检测，建立并实施植物检疫制度，防止带病的水稻种子向无病稻区去引入，从根本上防止稻粒黑粉病菌的传播和扩散。因此，从源头控制病害发生，加强病原菌的检测，为病害的预测预报、科学指导该病害的防治具有十分重要的意义。
　　稻曲病是由Ustilaginoidea virens(Cooke)Tanaka.引起的水稻谷粒真菌性病害。近年来，随着杂交水稻高产品种的大力推广和种植过程中氮肥使用水平的提高，稻曲病的田间发生逐年加重。稻曲病不但会影响水稻产量、降低稻米品质，还产生有害毒素对人和动物造成危害。目前防治稻曲病主要还是以药剂防治为主，因此对稻曲病菌进行严格监测和预报，对指导生产工作中药剂施用具有重要意义。
　　本研究采用Real-time PCR、dd PCR、MALDI-TOF-MS三种检测技术分别对稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子进行快速检测方法研究。针对稻粒黑粉病和稻曲病菌孢子建立了Real-time PCR快速检测体系;对dd PCR技术在稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的检测应用进行了评估;通过MALDI-TOF-MS技术对细胞内特征大分子物质进行鉴定，得到稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的特征指纹图谱。研究结果如下:
　　1、稻粒黑粉病菌孢子Real-time PCR快速检测体系的建立。基于Real-time PCR技术建立了稻粒黑粉病菌孢子量(y)和相应扩增Ct值(x)的标准曲线:y=-0.2966x+10.529，(R2=0.9974，P＜0.0001)。在定量种子中掺入已知浓度稻粒黑粉病菌孢子，其Real-time PCR检测结果与掺入孢子数存在极显著的正相关，无显著差异(R2=0.9329，P＜0.0001)。对Real-time PCR标准曲线进行了可靠性验证，技术重复的变异系数在0.46％-0.95％之间，表明本方法灵敏度高重复性好。
　　2、稻曲病菌孢子Real-time PCR快速检测体系的建立。基于Real-time PCR技术建立了稻曲病菌孢子量(y)和相应扩增Ct值(x)的标准曲线:y=-0.2689x+10.508，(R2=0.9937，P＜0.0001)。在定量种子中掺入已知浓度稻曲病菌孢子，其Real-time PCR检测结果与掺入孢子数存在极显著的正相关，无显著差异(R2=0.9329，P＜0.0001)。对Real-time PCR标准曲线进行了可靠性验证，技术重复的变异系数在0.45％-0.83％之间，该体系灵敏度高重复性好。
　　3、植物病原真菌孢子MALDI-TOF-MS检测规范化条件的建立。本试验从预处理方法、基质选用和点样方法三方面比较MALDI-TOF-MS分析结果，对影响特征图谱的主要因素进行优化。结果表明，稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子预处理方法对检测结果影响最大，确定热处理法在细胞壁较厚的真菌样品处理中能获得较完整的生物信息。构建了稻粒黑粉病菌孢子、稻曲病菌孢子MALDI-TOF-MS鉴定规范化方法，扩充MALDI-TOF-MS指纹图谱数据库，可对细胞壁加厚的真菌样品进行简便、快速、准确的鉴定。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1．2 稻粒黑粉病的侵染机制

1．1．3 稻粒黑粉病的流行规律

1．1．4 稻粒黑粉病的防治

1．2 稻曲病的研究进展

1．2．1 稻曲病的发生与危害

1．2．2 稻曲病的侵染机制

1．2．3 稻曲病的流行规律

1．2．4 稻曲病的防治

1．3 PCR技术在真菌病害检测的应用

1．3．1 PCR技术的发展应用

1．3．2 Real-time PCR技术的发展应用

1．3．3 dd PCR技术的发展应用

1．4 MALDI-TOF-MS技术在真菌病害检测的应用

1．4．3 MALDI-TOF-MS的数据库

2 引言

3 材料与方法

3．3 供试仪器

3．4 供试引物

3．5 病原真菌的分离和纯化

3．5．1 稻粒黑粉菌病谷的采集和保存

3．5．2 稻粒黑粉病菌孢子的获得

3．5．3 稻曲球的采集和保存

3．5．4 稻曲病菌孢子的获得

3．6 真菌基因组DNA提取

3．7 病原真菌孢子Real-time PCR检测体系的建立

3．7．3 Real-time PCR结果和显微计数结果的相关性

3．8 病原真菌孢子dd PCR检测体系的建立

3．8．1 ddPCR反应

3．8．2 dd PCR标准曲线的绘制

3．9 病原真菌孢子MALDI-TOF-MS检测体系的建立

3．9．3 MALDI-TOF-MS基质

3．9．5 重复性试验

3．9．6 数据库的完善

4 结果与分析

4．1．2 稻曲病菌孢子Real-time PCR标准曲线

4．1．3 可靠性检验

4．1．4 Real-time PCR结果和掺入孢子数检测结果的相关性

4．2 病原真菌孢子dd PCR检测体系的建立

4．2．1 稻粒黑粉病菌孢子dd PCR标准曲线

4．2．2 稻曲病菌孢子ddPCR标准曲线

4．3 病原真菌孢子MALDI-TOF-MS检测体系的建立

4．3．1 样品处理方法的确定

4．3．2 可靠性检验

4．3．3 MALDI-TOF-MS数据库的建立

5 讨论

5．1 Real-time PCR技术在植物病原真菌孢子检测中的应用

5．2 dd PCR技术在物病原真菌孢子检测中的应用

5．3 MALDI-TOF-MS技术在病原真菌鉴定中的应用

6 结论

6．5 植物病原真菌孢子MALDI-TOF-MS标准指纹图谱的建立

参考文献

个人简介

附录