粉纹夜蛾抗Bt Cry1Ac毒素细胞与敏感细胞的差异蛋白质组学初步分析

摘要

自1957年美国太平洋酵母公司生产出第一个苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis Bt)商品制剂以来，Bt杀虫剂作为一种对人畜安全、无环境污染、产量高、效果好的微生物杀虫剂，在农、林及卫生害虫的防治中发挥了重要作用，成为国内外开发应用最成功的一种生物农药。但随着它的广泛使用和多种转Bt基因植物的推广，害虫已经对Bt产生了明显的抗药性，因此如何治理好昆虫对Bt的抗性已成为害虫防治中的重要问题。只有弄清楚昆虫抗性形成的分子机制，才能制定出合理的抗性管理策略，延缓抗性的产生。 本实验室的前期工作已经证明了粉纹夜蛾离体培养的细胞能够对Bt杀虫晶体蛋白CrylAc产生一定水平的抗性，而且细胞系对Bt抗性特点与虫体的类似。因此本实验采用了对Bt CrylAc毒素十分敏感的BT1-TN-581细胞和同源的抗性细胞为实验材料，利用CrylAc毒素蛋白，经过连续的，高强度的抗性筛选，采用双向凝胶电泳和质谱联用技术，从蛋白质水平上来揭示两种细胞的差异。 通过双向电泳技术，得到了粉纹夜蛾对Bt CrylAc抗性细胞和敏感细胞的总蛋白质电泳图谱，以ImageMaster Elite 5.0v软件来分析，发现CrylAc抗性细胞的总蛋白质点平均为896个，敏感细胞的总蛋白质点平均为838个。大部分蛋白分布在14-100KD之间，大部分蛋白的pI主要在4-9之间，酸性段和碱性段基本上没有分离到蛋白质点。挖取了细胞总蛋白图谱中几个重复性良好的蛋白质点，将这些点进行了肽质指纹图谱鉴定，通过通过Mascot检索蛋白质数据库，找到了几个可能与其有同源性的蛋白质，通过计算机软件的分析，在分值上和肽段的覆盖率上最为接近的一个蛋白质A为变形菌门γ-变形菌纲Idiomarina loihiensis L2TR的鞭毛驱动蛋白(flagellar motor protein)，它与细菌质膜上的蛋白具有一定程度的同源性。表明该蛋白质可能是一种与细胞膜蛋白相似的蛋白。另外，对该点PMF的肽段分析发现该蛋白的1-44肽段与DNA甲酰氨基嘧啶-糖基化酶的肽段序列是完全匹配的，但要对其做出鉴定还需要进行N端测序来完成。蛋白质点B则没有找到与其匹配率较高的蛋白质。蛋白质点C则是与脂多糖生物合成蛋白具一定的同源性的蛋白质。这些蛋白可能与抗性的产生有直接或间接的关系。

目录

文摘

英文文摘

声明

Ⅰ研究背景

1蛋白质组学概述

1.1蛋白质组学定义

1.2蛋白质组学中用到的研究手段

2昆虫抗性机理的阐述

3本研究的目的和意义

Ⅱ实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1昆虫细胞

2.1.2大肠杆菌菌株

2.1.3培养基的配制

2.1.4溶液的配制

2.1.5其他常用试剂

2.1.6蛋白质分子量标准

2.1.7实验仪器

2.2实验方法

2.2.1 Cry1Ac毒素晶体的表达

2.2.2 Cry1Ac毒素的提取

2.2.3昆虫细胞培养

2.2.4 Cry1Ac毒素的纯化

2.2.5 Cry1Ac毒素的鉴定

2.2.6抗性细胞的获得(抗性筛选)

2.2.7细胞总蛋白的提取

2.2.8 双向电泳

2.2.9凝胶染色

2.2.10蛋白质点的采集与分析

2.2.11差异蛋白质点的肽质指纹质谱分析

Ⅲ实验结果与分析

3.1 Cry1Ac毒素对昆虫细胞培养的影响

3.1.1 Cry1Ac毒素的鉴定

3.1.2细胞的抗性筛选

3.2双向电泳图谱及分析

3.3 PMF结果分析

Ⅳ讨论

4.1讨论细胞总蛋白样品的制备对电泳效果的影响

4.2根据PMF结果与数据库的信息比对的分析

Ⅴ参考文献

附录

硕士期间完成的论文

致谢