粉纹夜蛾抗BtCrylAc毒素细胞与敏感细胞的差异蛋白初步分析

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，在芽孢形成过程中，可以产生伴孢晶体，这也是其杀虫的主要活性成分。
　　 Bt合成的杀虫晶体蛋白或转Bt基因植物表达的毒素蛋白对多种害虫具有特异性毒杀作用，被广泛地用于防治农业和卫生害虫，是环境友好的生物农药。然而Bt杀虫晶体蛋白能使害虫产生高水平的抗性，这Bt资源的可持续利用有很大影响。因此深入了解昆虫对Bt的抗性机制及其特点，才能制定出合理的抗性治理策略，从而降低害虫抗性的产生。
　　 本文在总结过去以苏云金芽孢杆菌工业制剂筛选培养的离体昆虫细胞来研究Bt抗性的发生、发展规律的基础上，为了进一步探讨单一的杀虫晶体蛋白诱导昆虫细胞产生抗性的规律和深入研究其抗性机制，我们以在大肠杆菌中表达的CrylAc毒素连续处理离体培养的粉纹夜蛾R-Tn－5B1细胞，目前已获得一株对CrylAc毒素产生较高抗性的细胞系，并从细胞蛋白质水平进一步探讨了其抗性产生的原因。主要结果如下：
　　 1.CrylAc毒素在大肠杆菌BL21中的转化与表达
　　 将携带有CrylAc编码基因的重组质粒pHT304载体转化到大肠杆菌BL21菌株中，扩大培养。将纯化的杀虫晶体蛋白酶和以50mM Na2CO3(pH10.5)溶液降解处理CrylAc毒素对粉纹夜蛾细胞有毒效。同时含CrylAc晶体编码基因的大肠杆菌培养物提纯杀虫晶体蛋白，用纯化的杀虫晶体蛋白以碱性溶液降解后经SDS-PAGE电泳分析，结果显示，有毒性多肽(MW66 KD左右)的存在。
　　 2.抗性粉纹夜蛾细胞系(R－Tn－5B1)的筛选及其抗性测定
　　 Tn－5B1细胞用CrylAc毒素连续处理，每5代以MTT法测定其抗性上升情况以及抗性粉纹夜蛾细胞R-Tn－5B1对CrylAc毒素的抗性比，离体生测结果表明，粉纹夜蛾Tn－5B1细胞对CrylAc毒素最敏感。第122代抗性衰退细胞的抗性比为128倍。继续筛选到第124代时，抗性持续增加，抗性比为181.9倍。此后，抗性的发展出现了一个大幅度的上升，筛选至第127代时抗性比已达634倍。目前筛选至第130代时抗性一直在增加，抗性比增加至1298.6倍。
　　 3.双向电泳及图谱分析
　　 根据ImageMaster2D Platinum6.0软件分析，统计了凝胶上所有的差异蛋白点，并初步分析量的差异。分别以粉纹夜蛾敏感细胞和抗性细胞总蛋白双向电泳图谱和粉纹夜蛾抗CrylAc的R-Tn-5B1细胞总蛋白双向电泳图谱为参照，在抗性细胞的2-DE总蛋白图谱上检测到的差异点主要集中在碱性端和分子量35.0-66.2KD之间且有2000个左右，经软件匹配和人工分析共得到表达量过量表达2-4倍的有24个，过量表达4倍以上的有14个；降低表达2-4倍有15个，降低表达4倍以上有18个，其中有显著差异点有7个。这些差异蛋白质可能与Bt抗性的产生存在某种直接或间接的关系。
　　 4.抗性粉纹夜蛾细胞和敏感细胞碱性磷酸酶活性的测定及比较
　　 磷脂酰肌醇锚定的碱性磷酸酶是CrylAc毒素的受体之一。通过对两种细胞提取的总蛋白进行碱性磷酸酶活性检测，计算单个细胞的碱性磷酸酶的活性，敏感细胞的碱性磷酸酶活性比抗性细胞的碱性磷酸酶活性高，但两种细胞总体的碱性磷酸酶活性都不高，从侧面可以推测两种细胞的碱性磷酸酶蛋白量存在差异，碱性磷酸酶量的减少可能是抗性细胞对毒素产生抗性因素之一，但它不是主要因素。