喹赛多对鸡产气荚膜梭菌的药动学-药效学同步关系及临床疗效研究

摘要

鸡坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的以肠道黏膜出血性坏死为主要特征的消化道传染病，具有较高的发病率和死亡率，给禽类养殖业造成了严重损失。喹赛多作为喹噁啉类新品种药物，对产气荚膜梭菌有较好的抗菌活性，且灌服给药后鸡消化道内药物浓度远远高于血药浓度，加之其毒副作用小，休药期短，适宜用作鸡坏死性肠炎的治疗药物，具有巨大开发潜能。本课题研究了喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌的体外和半体内抗菌作用及喹赛多在鸡消化道内的代谢动力学，通过建立喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌的半体内PK-PD模型，制定了喹赛多用于治疗鸡坏死性肠炎的给药方案，并按照基于PK-PD制定的给药方案，开展了喹赛多对鸡坏死性肠炎的随机对照治疗试验，为指导喹赛多临床应用提供了理论依据与基础实践。　　1.喹赛多对产气荚膜梭菌的药效学研究　　参考临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的相关标准文件，采用琼脂稀释法测定喹赛多对61株鸡源产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度(MIC)，使用SPSS软件对MIC值进行统计，计算得到喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌的MIC50和MIC90。筛选出MIC50附近且致病性较强的菌株，采用微量稀释法测定喹赛多在肉汤培养基和鸡回肠内容物中对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，通过平板涂布法将浓缩至1010 CFU/mL的产气荚膜梭菌菌液涂至含喹赛多的琼脂平板测定防突变浓度(MPC)，采用药物去除的方法测定喹赛多对产气荚膜梭菌的抗菌后效应(PAE)，分别用含有不同浓度喹赛多的培养基和各时间点采集的回肠内容物进行体外和半体外杀菌曲线试验。　　结果表明喹赛多对61株鸡源产气荚膜梭菌的MIC值介于1～16μg/mL，MIC50为2.11μg/mL，MIC90为4.40μg/mL，选取MIC50附近且致病性较强的菌株cvcc2030，在体外和半体内条件下测得喹赛多对产气荚膜梭菌cvcc2030的抗菌活性相同，MIC均为2μg/mL，MBC均为4μg/mL。喹赛多对产气荚膜梭菌cvcc2030的MPC为20μg/mL，将产气荚膜梭菌cvcc2030暴露在不同浓度喹赛多溶液中1h和2h，诱导产生的PAE分别为0.88～1.24 h和1.01～1.89h。体外和半体内杀菌曲线试验结果均显示喹赛多对产气荚膜梭菌的抗菌作用类型为浓度依赖型。　　2.喹赛多在鸡消化道内的药动学研究　　选用110羽4周龄三黄肉鸡，随机分为2组，每组55只，其中一组攻毒产气荚膜梭菌cvcc2030，构建坏死性肠炎疾病模型。疾病模型构建成功后，对健康组和疾病组鸡只均按30 mg/kg体重进行单次灌胃给药。于给药后0.5 h、0.75 h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24 h每个时间点分别取5只鸡进行定点宰杀，取其回肠内容物，采用高效液相色谱法(HPLC)测定各时间点回肠内容物中喹赛多的药物浓度。　　将测得的各时间点回肠内容物中喹赛多的药物浓度使用Winnonlin软件进行拟合，结果显示健康组和患病组的AUC分别为410.75 hμg/mL和361.82 hμg/mL，Cmax分别为172.89μg/mL和151.76μg/mL，T1/2λ分别为5.69 h和5.82 h，CL/F分别为72.44mL/kg/h和82.27 mL/kg/h，MRT分别为2.59 h和2.49 h。表明鸡灌服喹赛多后能在肠道达到较高浓度，但平均滞留时间较短，且健康组和患病组药动学参数并无明显差异。　　3.半体内PK-PD模型拟合与药给药方案制定　　利用Sigmoid Emax方程对半体内杀菌曲线试验中AUC24h/MIC值与产气荚膜梭菌浓度变化对数值进行拟合，计算当E=0、-3、-4时PK/PD参数AUC24h/MIC折点值。采用平衡透析法得到喹赛多在鸡消化道的游离药物比例，结合给药剂量公式:Dose=CL×(AUC/MIC)BP×MIC/F×fu，利用PK-PD参数AUC24h/MIC折点值计算达到预防、治疗和根除效应的日给药剂量。　　半体内PK/PD模型拟合得到的方程为E=2.80-7.29×(AUC/MIC)1.76/36.271.76+(AUC/MIC)1.76，当 E=0、-3、-4时计算得到的对应的抑菌、杀菌、根除作用的AUC24h/MIC折点值分别为27.71 h、78.93 h、165.14h。测得喹赛多在鸡消化道的游离药物比例为0.47，结合给药剂量公式，针对本试验受试菌株，得到的预防、治疗和根除鸡坏死性肠炎的日给药剂量为9.70、27.63、57.81 mg/kg，将日给药剂量转化为饲料添加剂量分别为100、300、600mg/kg。　　4.随机对照治疗试验　　将210羽3周龄科宝肉鸡随机分为6组:健康对照组35羽，不感染不给药;阴性对照组35羽，感染不给药;阳性对照组35羽，感染给予磷酸泰乐菌素预混剂200mg/kg饲料混饲给药;试验组根据基于PK/PD制定的给药方案，低、中、高剂量组分别按150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg饲料混饲给药，每组35羽。对各组的疗效指标、肠道损伤程度及产气荚膜梭菌活菌菌落数进行统计。　　结果显示喹赛多低、中、高剂量组的死亡率分别为17.14％、11.43％、8.57％，有效率分别为77.14％、85.71％、91.43％，治愈率分别为71.43％、85.71％、91.43％，平均日增重分别为53.24 g、62.64 g、65.74g，料重比分别为2.19、2.00、1.94，肠道病变记分分别为0.97、0.69、0.54，产气荚膜梭菌活菌菌落数(LogCFU/g)为6.25、5.45、4.67。喹赛多中、高剂量组各指标间无显著性差异，综合各方因素，当临床分离菌株MIC≤2μg/mL时，推荐以300 mg/kg饲料混饲治疗鸡坏死性肠炎。　　本课题阐明了喹赛多对鸡产气荚膜梭菌的抗菌特性，揭示了喹赛多在健康鸡和患病鸡消化道内的药动学特点，建立了喹赛多对鸡坏死性肠炎的半体内PK-PD模型，制定了喹赛多用于预防、治疗、根除鸡坏死性肠炎的给药方案，并开展随机对照治疗试验对给药方案进行验证，对有效控制鸡坏死性肠炎，同时丰富喹赛多的临床应用具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题依据

1．2 国内外研究进展

1．2．1 喹赛多对鸡源致病菌的药效学研究

1．2．2 喹赛多在鸡体内的药动学研究

1．2．3 抗菌药物PK-PD模型研究进展

1．3 研究内容和目标

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究目标

2 材料与方法

2．1 药品与试剂

2．1．1 药品

2．1．2 试剂

2．2 仪器与设备

2．3．1 菌种

2．3．2 动物

2．4 致病性产气荚膜梭菌的筛选

2．4．1 菌种复苏与培养

2．4．2 产气荚膜梭菌体外敏感性测定

2．4．3 小鼠毒力试验

2．5 喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌药效学研究

2．5．1 产气荚膜梭菌生长曲线的绘制

2．5．2 最小抑制菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

2．5．3 体外和半体内杀菌曲线的绘制

2．5．4 防突变浓度(MPC)的测定

2．5．5 抗菌后效应(PAE)测定

2．6 喹赛多在鸡消化道中的药动学研究

2．6．1 喹赛多在鸡回肠内容物中检测方法的建立

2．6．2 人工感染鸡坏死性肠炎模型的建立

2．6．3 给药与采样

2．6．4 游离药物比例的测定

2．7 PK-PD模型的建立及给药方案的制定

2．7．1 药动学模型拟合

2．7．2 半体内PK-PD模型的拟合

2．7．3 给药剂量及给药间隔的确定

2．8．1 试验动物分组与治疗方案

2．8．2 人工诱发鸡坏死性肠炎

2．8．3 感染结果的确诊

2．8．4 病理剖检及组织病理学检查

2．8．5 疗效指标判定

2．8．6 数据分析

3 结果与分析

3．1 致病性产气荚膜梭菌的筛选

3．1．1 喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌的MIC值分布

3．1．2 小鼠毒力试验

3．2 喹赛多对鸡源产气荚膜梭菌的药效学

3．2．1 产气荚膜梭菌的生长曲线

3．2．2 体外和半体内MIC、MBC的测定

3．2．3 体外和半体内杀菌曲线

3．2．4 MPC和PAE的测定

3．3 喹赛多在鸡消化道的药动学

3．3．1 定量方法学

3．3．2 鸡的肠道药物代谢动力学

3．4 PK-PD模型的拟合

3．4．1 喹赛多在鸡消化道内的PK／PD参数

3．4．2 喹赛多半体内PK／PD参数

3．4．3 半体内PK-PD模型的拟合

3．5 给药方案的制定

3．5．1 游离药物比例

3．5．2 给药剂量和给药间隔

3．6 喹赛多对鸡产气荚膜梭菌的临床疗效

3．6．1 人工感染及病例确诊

3．6．2 病理剖检及组织病理学检查

3．6．3 临床疗效评价

4 讨论

4．1 喹赛多对产气荚膜梭菌的药效学特点

4．2 喹赛多在鸡的药动学特征

4．3 半体内PK-PD模型的拟合

4．4 给药方案的制定

4．5 喹赛多对鸡坏死性肠炎的疗效评价

5 全文总结

6 文献综述

6．1 病原

6．2 主要毒素

6．3 流行病学

6．4 临床症状与病理剖检

6．5 防治措施与常用药物

6．5．1 防治措施

6．5．2 常用药物

6．6 防治研究新方向

参考文献

研究生简介

附录

致谢