miRNA及其靶标和转录因子的染色体定位及表达分析

摘要

microRNAs(miRNAs)是一类内源性表达的非编码的小分子RNA，它对基因的转录和表达起着重要的负调控作用，主要通过与其靶基因的完全配对降解靶基因或者不完全配对阻遏靶基因的翻译来发挥作用，在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。自2002年第一个植物miRNA被报道以来，越来越多的植物miRNA被相继发现，主要通过高通量测序分析和生物信息学预测的方法进行miRNA及其靶基因的发掘工作。为了研究miRNA及其靶标在棉花染色体上的分布情况，我们对到2011年4月为止所公布的miRNA前体及潜在的靶基因序列进行引物开发，最终得到了83对miRNA前体特异引物和1255对靶基因特异引物。对这些引物进行多态性分析，最终9个miRNA前体多态性位点被定位到棉花26条染色体的其中7条上;156个靶基因多态性位点被定位到棉花的26条染色体上。由于所得到的有多态性的miRNA引物数目较少，为了定位更多的miRNA，miRNA-SRAP技术被应用于本实验中进行多态性分析，最后59个多态性位点中的54个被定位到除Chr01、Chr22和Chr24外的另23条染色体上。从染色体定位结果可以看出miRNA标记在染色体上分布均匀，而靶标的分布却呈现一定的偏好性。然后对这些定位到染色体上的miRNA及其靶标根据他们之间的调控关系利用Circos进行连线作图，得到了miRNA及其靶标间的在染色体上调控网络图。对83对miRNA引物以及随机选择的的98对靶标引物进行RT-PCR和qRT-PCR分析，在亲本间纤维发育各时期显示出了独特的表达模式。本研究为miRNA及其靶标在染色体上的分布以及它们之间调控网络的研究提供了一个全面的概述。在鄂棉22和3-79间的表达分析为研究miRNA在棉花纤维发育过程中起何种调控作用提供了一定的基础。　　 转录因子(transcription factor，TF)作为一类重要的反式作用因子，在棉花的生长发育过程中起着重要的调控作用。本实验主要研究转录因子的染色体定位情况和在纤维发育各时期的表达情况，对转录因子的50个家族的1116条序列进行引物设计，得到了977对转录因子特异引物;对这些转录因子引物进行染色体定位，最终有31个转录因子标记被添加到棉花海陆种间遗传连锁图上。31个转录因子标记分布在棉花的15条染色体上，其中Chr05、Chr11、Chr19和Chr20这四条染色体上包含15个转录因子标记，占总数的48.4％，因此转录因子在染色体上的分布呈现出一定的偏好性，对每个家族随机选择的两对引物进行RT-PCR和qRT-PCR分析，发现大部分有表达的标记在亲本的纤维发育各时期表达量有显著差异，这表明转录因子在纤维的生长发育过程中发挥作用，这对于棉花纤维产量的增加和纤维品质的提高具有重要的意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 microRNA简介

1．1．1 miRNA的发现

1．1．2 植物miRNA的生物合成途径

1．1．3 miRNA的特点

1．1．4 miRNA作用机理

1．1．5 植物miRNA的功能

1．1．6 miRNA及其靶标的检测

1．2 转录因子简介

1．2．1 转录因子功能结构域

1．2．2 植物转录因子的研究方法

1．2．3 转录因子的功能

1．3 本研究的内容及目的意义

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究的目的意义

第二章 miRNA及其靶基因的染色体定位及表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 miRNAs及靶基因的引物开发

2．1．3 miRNA-SRAP技术可靠性的验证方法

2．1．4 PCR扩增及电泳

2．1．5 带型记录方法

2．1．6 数据分析

2．1．7 miRNAs及其靶标的RT-PCR和qRT-PCR分析

2．1．8 miRNAs与其靶标之间相互关系网络图的绘制方法

2．2 结果与分析

2．2．1 序列挖掘及引物设计结果

2．2．2 miRNA-SRAP标记技术的可靠性分析

2．2．3 遗传连锁图构建分析

2．2．4 RT-PCR和qRT-PCR结果分析

2．2．5 miRNAs与其靶标在网络图上的分布规律分析

2．3 讨论

2．3．1 miRNA及其靶标引物的开发策略

2．3．2 miRNA在染色体上的均衡分布以及靶标的偏好分布

2．3．3 miRNA及其靶标在亲本间的的差异表达

2．3．4 由网络图显示出的遗传进化

第三章 转录因子的染色体定位及表达分析

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 转录因子的挖掘及引物设计

3．1．3 PCR扩增和电泳

3．1．4 带型记录方法和数据分析

3．1．5 转录因子的RT-PCR和qRT-PCR分析

3．2 结果和分析

3．2．1 转录因子序列的挖掘及引物设计结果

3．2．2 转录因子的引物多态性及染色体定位

3．2．3 转录因子的RT-PCR和qRT-PCR分析

3．3 讨论

3．3．1 转录因子标记的开发策略分析

3．3．2 转录因子在染色体上的偏好分布

3．3．3 转录因子在亲本间的差异表达

参考文献

致谢

附录

附录1 研究生阶段发表论文情况