苹果miRNAs调控靶标基因参与寄主与苹果树腐烂病菌互作分析

摘要

由Valsa mali引起的苹果树腐烂病在中国苹果产区发生普遍，危害严重，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了苹果产业的发展。但由于缺乏病菌致病机理和寄主抗性的认识，生产上一直处于被动防治的状态，解析苹果树与V. mali的互作机制对病害防治和抗病育种具有重要意义。miRNA是一类内源小分子非编码RNA，可在转录后水平调控基因的表达参与植物与病原物互作过程。为了解析苹果树miRNAs调控寄主与V. mali互作的机理，本研究以伤口接种V. mali和PDA的富士苹果树枝条韧皮部组织构建small RNA文库，结合苹果基因组库，利用miRBase21.0数据库中已知的miRNAs鉴定保守miRNAs，依据miRNA和pre-miRNA的特征预测新的miRNAs，并分析对照和V. mali胁迫下差异表达的miRNAs；同时利用降解组高通量测序技术对相同样品测序鉴定靶标基因，并对差异表达miRNAs的靶标基因进行分析。主要结果如下： 1.构建了BMd（对照）和IVm（处理）两个small RNA文库，获得了来自138个前体的187条保守miRNAs，来自1178个前体的1189条新的候选miRNAs。其中BMd库有173条保守miRNAs，对应137个前体，有1164条新的候选miRNAs，对应1157个前体；IVm库有174条保守miRNAs，对应131个前体，有1179条新的候选miRNAs，对应1175个前体。 2.V. mali胁迫导致苹果树枝条miRNAs差异表达。BMd和IVm库中分别有23和39条miRNAs属于特异表达，1314条miRNAs属于共同表达；在侵染过程中，113条miRNAs上调表达，40条miRNAs下调表达（p ≤ 0.01，| log2（foldchange）| ≥ 1）。 3. 构建了TBMd（对照）和TBVm（处理）两个降解组文库，鉴定到353条miRNAs （包含158条属于保守miRNAs）靶向1077个功能基因，其中差异表达的miRNA（p ≤0.01）对应到106条靶基因。这些鉴定到的靶基因大部分属于转录因子，如NAC、TCP、MYB、SPL、SCL、ARF等，和部分抗病基因，如AFB2、At1g12290、RPM1、RPPL1、SNC1、WRKY33等，以及少数功能未知的序列。 4. 所有靶基因富集结果显示，参与的生化进程主要是“转录调控”、“细胞凋亡”、“植物超敏反应”、“防卫反应”和“生长素介导的信号通路”等；BMd和IVm库中差异表达的miRNAs对应的靶基因主要富集到“转录调控”、“生长素介导的信号通路”、“细胞核”和“SCF泛素连接酶复合体”，并分布在 124条KEGG通路里，最显著富集的通路包括“半胱氨酸和甲硫氨酸代谢”、“核糖体”、“自噬调控”和“蛋白质外运”等。 5. miRNAs与靶基因调控网络十分复杂，一条miRNA可以有多个靶标基因，同一个基因可以被多条miRNAs调控，且miRNA反馈调控sRNA通路关键元件Dicer和AGO蛋白。重要的是，高表达的保守的mdm-miR482b可能调控了多条抗病基因，其在侵染过程中下调表达，同时9条中度表达的新的miRNAs共同调控对几丁质反应的、在侵染过程中上调表达ATL2，暗示了这些miRNAs调控靶基因对寄主应答V. mali胁迫发挥了重要功能。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 miRNAs概述

1.2.1 植物miRNAs的特征，产生和作用机制

1.2.2 植物miRNAs调控生长发育

1.2.3 植物miRNAs调控抗逆反应

1.2.4 果树miRNAs研究进展

1.2.5 植物miRNAs的研究方法

1.3 苹果树腐烂病与苹果树互作研究进展

1.3.1 苹果树腐烂病的发生与危害

1.3.2 苹果树腐烂病菌潜伏侵染

1.3.3 苹果树腐烂病菌致病机理研究

1.3.4 苹果树对腐烂病的抗性研究

1.4 本研究的目的与意义

第二章 苹果树miRNAs鉴定及分析

2.1 材料方法

2.1.1 材料、仪器及试剂

2.1.2 试验方法

2.2.1 small RNA测序

2.2.2 苹果树枝条韧皮部中保守的、新的miRNAs

2.2.3 苹果树枝条韧皮部miRNAs保守性分析

2.2.4Valsa mali胁迫下苹果树miRNAs差异表达

2.3 结论与讨论

第三章 靶标基因鉴定及生物学功能分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试验材料、仪器及试剂

3.1.2 试验方法

3.2.2 靶基因生物学功能分析

3.2.3 miRNAs-靶基因调控网络

3.2.4 关键miRNAs/靶基因及定量分析

3.3 结论与讨论

全文总结

参考文献

附录

附表1 差异表达的苹果miRNA

附表2 差异表达miRNAs与其靶标基因

致谢

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