结核分枝杆菌中金属内酰胺酶的功能鉴定及其与分子伴侣蛋白的相互作用研究

摘要

结核分枝杆菌(M. tuberculosis)是一种传染性很强的病原菌，能够感染人畜引发结核病，通常为肺结核。结核分枝杆菌有极强的抗逆性，能够长期潜伏在活体内，它们通过合成降解药物蛋白（如内酰胺酶）、使药物靶标发生突变等机制产生抗药性。本论文研究在结核分枝杆菌中发现了Rv2752c同时兼有内酰胺酶活性和RNase活性等双重功能，具体结果如下：　　（1）生物信息学分析表明，Rv2752c属于金属内酰胺酶家族中β-CASP亚家族，同时含有RMMBL结构域，可能兼有RNase和内酰胺酶的双重功能；通过氨基酸序列比对发现Rv2752c与RNaseJ具有很高的同源性。（2）针对该基因通过系列点突变和缺失突变，表达纯化得到了野生型和突变蛋白，发现Rv2752c同时具有内酰胺酶和RNase双重活性。两个残基D184和H397被证实参与金属离子的结合而且对于蛋白的双重活性是必须的。C-末端的108个氨基酸残基的缺失也导致Rv2752c的内酰胺酶和RNase活性的丧失。（3）通过细菌双杂交筛选和PULL-DOWN证实Rv2752c能与Rv2373c相互作用，进一步分析发现Rv2373c能够抑制Rv2752c的双重活性。　　这是第一次在结核分枝杆菌中发现并证实一个蛋白同时兼有内酰胺酶和RNase双重功能，这不仅提高了我们对于结核分枝杆菌中mRNA的成熟加工与耐药机制的理解，而且该研究对于阐明微生物的内酰胺酶的结构与功能及其与细菌抗药之间的关系等具有重要意义。

目录

声明

缩略语表

第一章 前言

1.结核分枝杆菌感染现状

2.细菌抗药性的产生

2.1细菌抗药途径

2.2β-内酰胺酶的分类

3 课题研究的目的意义与目标

4课题研究主要内容

第二章 材料与方法

1 材料

1.1供试菌株

1.2 酶、试剂和试剂盒

1.3 供试抗生素

1.4 引物

1.5 供试质粒

1.6 其余缓冲液、试剂

1.7培养基

2 方法

2.1 分子生物学基本操作

2.2 细菌双杂交实验

2.2.2 细菌双杂交质粒的构建

2.3 融合蛋白的亲和纯化

2.4 大分子相互作用检测

2.5 RNase 功能试验

2.6 淀粉/碘显色实验

2.7 分光光度法测内酰胺酶活性

第三章 结果与分析

1 Rv2752c属于金属内酰胺酶家族中β-CASP亚家族中的一员

1.1 Rv2752c在CDD中的结构预测

1.2 Rv2752c与其他革兰氏阴性菌中金属内酰胺酶氨基酸序列比对

1.3 Rv2752c具有β-CASP亚家族三个标志性的motif

1.4 Rv2752c与结核分支杆菌中的内酰胺酶序列比对

2 细菌双杂交以及相关蛋白的克隆表达

2.1 相关基因以及突变的克隆

2.2 细菌双杂交筛选

2.3 细菌双杂交验证相互作用

3 Rv2752c是结核分枝杆菌中的RNaseJ

3.1 Rv2752c与RNaseJ有很高的同源性

3.2 Rv2752c的同源建模

4 Rv2752c的内酰胺酶活性和RNase活性的测定

4.1 利用淀粉/碘显色实验验证Rv2752c的内酰胺酶活性

4.2 分光光度法测Rv2752c及其突变蛋白的内酰胺酶活性

4.3 Rv2752c的RNase活性实验

5 Rv2752c与Rv2373c体外相互作用检测

6 Rv2373c对Rv2752c活性的影响

6.1 Rv2373c对Rv2752c RNase活性的影响

6.2 Rv2373c对Rv2752c 内酰胺酶活性的影响

第四章 总结与讨论

1 总结

2.讨论

2.1 关于结核分枝杆菌中金属内酰胺酶的研究及讨论

2.2 关于RNaseJ的研究及讨论

2.3 Rv2752c与Rv2373c的互作研究以及讨论

2.4 Rv2752c与Rv2550c的互作讨论

3 研究展望

参考文献

致谢