伊维菌素和莫西克汀诱导胶质瘤细胞凋亡作用及机制的研究

摘要

神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。目前主张综合疗法，以手术切除为主，术后配合放疗、化疗、免疫治疗及生物治疗等，通常可延缓肿瘤复发，延长病人生存期，但尚未取得满意疗效。开发新型有效的治疗药物仍然尤为重要。大环内酯类药物，具有高效广谱性，研究发现可以逆转肿瘤多药耐药(MDR)，对非耐药肿瘤细胞具有杀伤性，而且这类药物毒副作用小、疗效佳，一般很少引起不良反应。但由于缺乏相关的研究基础，大环内酯类药物作为抗肿瘤药物的使用并不多。因此，本实验选用伊维菌素(Ivermectin，IVM)和莫西克汀(Moxidectin，MOX)检测该类药物对胶质瘤细胞的生长活力的影响，以初步了解药物对胶质瘤细胞的抑制作用;在此基础上利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率和周期DNA含量的变化;透射电镜观察细胞凋亡特征;Western blotting和RT-PCR法分析线粒体相关凋亡蛋白和周期蛋白的表达量;在动物体内实验中，利用免疫组织化学染色法(HE、TUNEL、Ki67、Cleaved caspase-3以及Cleaved caspase-9染色)研究了药物对胶质瘤细胞的抑制、凋亡作用及机制，旨在开发一类胶质瘤治疗的有效药物。　　研究结果如下:　　(1)伊维菌素、莫西克汀对胶质瘤细胞的抑制作用　　在体外，采用MTT方法检测细胞的活力。结果表明，随着药物浓度的升高，其胶质瘤细胞的活力明显下降。其次，利用细胞平板克隆形成实验检测药物对胶质瘤细胞克隆形成能力的影响，结果显示，随着药物浓度的升高，其克隆能力下降导致其集落形成率显著降低。　　(2)伊维菌素、莫西克汀将胶质瘤细胞阻滞在周期G0/G1期的作用及机制　　流式结果表明，与对照组相比，经药物处理48 h之后的G0/G1期DNA含量明显增加，而S期明显降低，且呈剂量依赖效应(P＜0.001)。药物处理之后用western blotting法检测其周期蛋白表达量，结果显示，CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1和Cyclin E表达明显下调，且呈剂量依赖效应。　　(3)伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞发生凋亡的作用及机制　　在体内，TUNEL法检测显示，经药物处理之后的TUNEL阳性细胞数与对照组相比明显增加;在体外，流式结果表明，药物处理48 h之后细胞凋亡率明显高于对照组，且呈剂量依赖效应(P＜0.001);另外，caspase酶活性检测结果说明，随着药物浓度的增加，其caspase-3和caspase-9酶活性逐渐升高。随后用western blotting、RT-PCR法检测其凋亡蛋白表达量，结果表明，促凋亡蛋白Bax的表达显著上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调，导致细胞质内Cytochrome-c的释放，从而激活caspase-3和caspase-9的表达，且呈剂量依赖效应。　　(4)伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞超微结构的形态学变化　　透射电镜结果显示，药物处理后的细胞呈现典型的凋亡特征:细胞皱缩、染色质浓缩，细胞质及大多数线粒体出现空泡化现象，同时伴随一些凋亡小体及自噬泡的产生。　　(5)在胶质瘤动物模型中，伊维菌素、莫西克汀对胶质瘤细胞的抑制作用及机制　　宏观上，药物处理之后的裸鼠肿瘤体积明显小于对照组，差异性显著（P＜0.01），而且药物处理后，肿瘤生长缓慢;而裸鼠的体重在各组间无统计学差异(P＞0.05);同时，免疫组化检测结果说明药物处理后Ki67阳性细胞数与对照组相比明显降低，而Cleaved caspase-3与Cleaved caspase-9的阳性细胞数明显增加(P＜0.01)。　　综上，本研究表明，伊维菌素和莫西克汀在体外、体内均能有效抑制胶质瘤细胞C6和U251的增殖，同时在体外可以通过caspase途径调节线粒体相关蛋白水平诱导细胞凋亡，下调相关周期蛋白的表达将细胞周期阻滞在G0/G1期。因此，伊维菌素，莫西克汀可能成为治疗胶质瘤的有效药物。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 神经胶质瘤

1．1．1 神经胶质瘤的简介

1．1．2 神经胶质瘤的治疗

1．2 大环内酯类药物的研究进展

1．2．1 药理作用

1．2．2 治疗作用

1．2．3 伊维菌素的发现及应用

1．2．4 莫西克汀的发现及应用

1．3 抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制

1．3．1 诱导细胞分化

1．3．2 促进细胞凋亡

1．3．3 信号传导通路

1．4 本课题的研究内容

1．5 本课题的研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞及裸鼠

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 主要试剂配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 体外增殖实验

2．2．3 细胞周期分析

2．2．4 细胞凋亡检测

2．2．5 透射电镜观察

2．2．6 caspase活性检测

2．2．7 Western blotting实验

2．2．8 RT-PCR实验

2．2．9 体内增殖实验

2．2．10 统计分析方法

3 结果分析

3．1 伊维菌素、莫西克汀在体外抑制胶质瘤细胞的增殖

3．2 伊维菌素、莫西克汀体外诱导细胞G0／G1周期阻滞

3．3 伊维菌素、莫西克汀体外诱导细胞凋亡

3．4 伊维菌素、莫西克汀诱导细胞超微结构形态学变化

3．5 伊维菌素、莫西克汀对相关周期蛋白表达量的影响

3．5．1 相关周期蛋白的表达

3．5．2 线粒体相关凋亡蛋白的表达

3．6 相关凋亡基因的表达结果

3．7 caspase活性检测

3．8 伊维菌素、莫西克汀对胶质瘤细胞荷瘤模型的影响

3．8．1 HE染色

3．8．2 TUNEL染色

3．8．3 免疫组织化学染色

4 讨论

4．1 伊维菌素、莫西克汀对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

4．2 伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制

4．3 伊维菌素、莫西克汀诱导胶质瘤细胞周期阻滞的分子机制

4．4 伊维菌素和莫西克汀对荷神经胶质瘤模型的体内研究

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文