METTL3调节奶牛乳腺乳蛋白和乳脂肪合成的分子机制

摘要

乳中最为重要的是乳蛋白和乳脂肪的含量以及组成，但中国牛奶中乳蛋白和乳脂肪的含量较低，寻找调控乳蛋白、乳脂肪关键信号分子为提高奶牛乳品质提供重要的实验依据。METTL3（methyltransferase-like protein3）也称m6A甲基转移酶，能够催化mRNA生成m6A。大量研究表明METTL3通过调控mRNA中m6A甲基化水平，进而对细胞中蛋白质的合成起到重要的调节作用。实验室前期结果表明，METTL3通过调节mTOR和SREBP-1c基因的表达，从而影响BMECs中乳蛋白、乳脂肪的表达。本实验拟研究METTL3促进mTOR和SREBP-1c基因的表达和分子机制，以及p-GlyRS作用于METTL3的分子机制。甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)具有非经典功能，通过蛋白质免疫共沉淀质谱分析表明，GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式与其下游蛋白METTL3结合，实验室前期研究表明p-GlyRS可能具有激酶活性，p-GlyRS可能使METTL3磷酸化。从而激活METTL3，本研究揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。　　组织块法获取奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs），利用免疫荧光法及Western blotting(WB)检测BMECs中CK18(Cytokeratin18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达，对METTL3基因进行过表达、干扰，WB实验检测BMECs中β-casein的表达情况，同时利用甘油三酯试剂盒检测BMECs中甘油三酯的表达。通过Dot blot实验检测BMECs中mRNA m6A的表达情况。RIP实验检测METTL3靶蛋白mTOR和SREBP-1c的mRNA m6A表达情况。FRET实验，分析两蛋白之间的相互作用。通过激光共聚焦共定位实验，分析添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3相互作用有何变化。通过体外激酶实验检测p-GlyRS能否激活GST-METTL3。　　实验结果表明获得了具有泌乳功能的奶牛乳腺上皮细胞。METTL3过表达后，β-casein的表达量增加同时细胞内脂滴数量明显增多，脂滴体积变大，细胞中TAG合成量增加。而当METTL3抑制时，β-casein的表达量降低同时细胞内脂滴数量减少，脂滴体积变小，细胞中TAG合成量降低。RIP实验结果表明METTL3过表达、干扰后BMECs中mTOR和SREBP-1c的mRNA m6A表达增多、减少。FRET结果表明p-GlyRS与METTL3的FRET值大于20％，激光共定位实验表明，添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3的相互作用增加，体外激酶实验表明，p-GlyRS能够使METTL3磷酸化。　　综上所述，METTL3是BMECs中重要的信号分子，正向调控BMECs中乳蛋白和乳脂肪的合成。METTL3能够正向调控mRNA m6A水平，正向调控靶基因mTOR和SREBP-1c的mRNA m6A水平。p-GlyRS与METTL3有直接相互作用，蛋氨酸和雌激素能够促进p-GlyRS与METTL3的结合。体外激酶活性实验表明p-GlyRS能够使GST-METTL3磷酸化。以上实验有助于揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育与泌乳

1．1．1 乳蛋白和乳脂肪的合成代谢

1．1．2 奶牛乳蛋白和乳脂肪合成主要信号转导途径研究

1．2 RNA N6-甲基腺苷(m6A)研究进展

1．2．1 M6A甲基化概述

1．2．2 M6A功能的研究

1．3 METTL3的研究进展

1．3．1 METTL3概述

1．3．2 METTL3生物学功能研究

1．4 氨酰tRNA合成酶的相关研究

1．4．1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能

1．4．2 甘氨酰tRNA合成酶的相关研究

1．5 实验目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验动物与细胞

2．1．4 试剂的配制

2．2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定

2．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化

2．2．2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

2．2．3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存

2．3 METTL3对BMECs乳蛋白及乳脂肪合成的影响

2．3．1 METTL3过表达对BMECs乳蛋白及乳脂肪合成的影响

2．3．2 METTL3抑制对BMECs乳蛋白及乳脂肪的影响

2．4．1 METTL3过表达对BMECs中mRNA m6A水平的影响

2．4．2 METTL3抑制对BMECs中mRNA m6A水平的影响

2．4．3 METTL3对其靶基因mRNA m6A水平的影响

2．5 p-GlyRs与METTL3相互作用的机理研究

2．5．1 激光共聚焦共定位分析p-GlyRs与METTL3的相互作用

2．5．2 FRET验证p-GlyRs与METTL3的相互作用

2．6 GlyRS对METTL3的体外激活

2．6．1 METTL3的原核表达与纯化

2．6．2 体外激酶实验检测p-GlyRS对METTL3的磷酸化作用

2．7 数据分析

3 结果与分析

3．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

3．1．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化

3．1．2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

3．2 METTL3过表达对BMECs乳蛋白及乳脂肪合成的影响

3．2．1 METTL3过表达载体的构建

3．2．2 METTL3过表达对BMECs乳蛋白相关蛋白表达变化

3．2．3 METTL3过表达对BMECs乳脂肪合成的影响

3．3 METTL3抑制对BMECs乳蛋白及乳脂肪合成的影响

3．3．1 METTL3干扰片段的转染

3．3．2 METTL3抑制对BMECs乳合成相关蛋白表达变化

3．3．3 METTL3抑制对BMECs乳脂肪合成的影响

3．4 METTL3对BMECs中mRNA m6A水平的影响

3．4．1 METTL3过表达对BMECs中mRNA m6A水平的影响

3．4．2 METTL3抑制对BMECs中mRNA m6A水平的影响

3．4．3 METTL3对其靶基因mRNA m6A水平的影响

3．5 p-GlyRS与METTL3相互作用的研究

3．5．1 相关载体的构建

3．5．2 METTL3基因在乳腺上皮细胞中的定位

3．5．3 激光共聚焦共定位分析p-GlyRS与METTL3的相互作用

3．5．4 FRET验证p-GlyRS与METTL3的相互作用

3．6 p-GlyRS对METTL3的体外激活

3．6．1 METTL3的原核表达与纯化

3．6．2 体外激酶实验检测P-GlyRS对姬TTL3的磷酸化作用

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

4．2 METTL3对乳蛋白及乳脂肪合成的影响及其机理

4．2．1 METTL3对乳蛋白及乳脂肪合成的影响

4．2．2 METTL3对BMECs中mRNA m6A水平的影响

4．3 p-GlyRS调节METTL3的分子机理

4．3．1 p-GlyRS与METTL3的相互作用

4．3．2 纯化后的p-GlyRS蛋白与METTL3激酶反应

4．4 蛋氨酸、雌激素对METTL3的调节作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文