METTL3对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的调控及其作用机理

摘要

乳蛋白和乳脂肪是在哺乳动物的乳腺上皮细胞中被合成的，其合成的过程及调控是非常重要的代谢过程。乳蛋白和乳脂的合成机理是很重要的生命科学问题，近年来，越来越多的研究去揭示乳蛋白及乳脂肪合成的机理，但是研究进展却很少。现已发现mTOR信号通路主要调控乳蛋白的生成，而SREBP-1c促进脂类合成，但氨基酸和激素如何调节mTOR和SREBP-1c尚不很清楚。有研究表明，m6A甲基转移酶(methyltransferase-like protein3，METTL3)可以通过调控mRNA中m6A甲基化水平，进而对细胞中蛋白质的合成起到重要的调节作用，但其是否能够调节乳腺中乳蛋白和乳脂肪的合成尚未见报道。本试验首次研究METTL3在牛乳腺细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）中对乳蛋白和乳脂肪的调节作用及其分子机理。
　　本实验中，采用了组织块培养法体外培养并纯化的奶牛乳腺上皮细胞，用蛋白质免疫印记(Western blotting)和免疫荧光(Imunofluorescience，IF)检测细胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。
　　应用Western blotting检测METTL3超表达和抑制时METTL3对BMECs中乳蛋白和乳脂的影响。结果显示，当过表达METTL3时，mTOR、GlyRS、CSN2、SREBP-1c等表达量均增加p-mTOR、p-GlyRS的表达水平也有明显的升高;当抑制METTL3时，mTOR、GlyRS、CSN2、SREBP-1c等表达量均减少，p-mTOR、p-GlyRS的表达水平也有明显的降低。表明METTL3可以通过调控乳脂、乳蛋白的相关信号通路分子的基因表达进而影响乳脂、乳蛋白的合成。
　　实验通过建立β-雌激素(E)和蛋氨酸(Met)刺激的BMECs模型，利用IF法检测添加E和Met时METTL3定位和表达变化。结果显示，METTL3主要分布在核内，添加E和Met可以上调METTL3的表达，增加METTL3的核定位。
　　本实验选用免疫共沉淀(Co-IP)技术沉淀并鉴定了细胞中METTL3的相互作用蛋白GlyRS。结果显示，METTL3与GlyRS在胞核中结合。添加Met或E后利用siRNA对GlyRS进行干扰，应用Western blotting检测mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS、和METTL3的表达量以及p-mTOR、p-GlyRS表达水平的变化。结果显示，GlyRS干扰后，阻断了Met和E对CSN2、SREBP-1c、p-mTOR的蛋白水平的促进作用。对GlyRS进行过表达同时利用siRNA干扰METTL3，Western blotting检测发现，过表达GlyRS后mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS和METTL3的表达量明显升高，但同时干扰METTL3后GlyRS对mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS和METTL3的表达的促进作用仍然存在但明显降低，p-mTOR、p-GlyRS的表达水平也有明显的降低。这说明，GlyRS介导Met或E信号部分通过调节METTL3从而调节mTOR和SREBP-1c基因表达控制乳脂肪和乳蛋白的合成。
　　综上所述，METTL3作为一个重要的信号分子，可以正向调节BMECs的合成。当G1yRS接受Met或E的刺激后，可以促进METTL3的表达，通过上调mTOR、SREBP-1c以及GlyRS的表达量，提高p-mTOR、p-GlyRS的表达水平以促进乳蛋白和乳脂肪的合成。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．2 乳蛋白和乳脂肪的合成代谢

1．1．3 奶牛乳蛋白和乳脂肪合成主要信号转导途径研究

1．2 METTL3的研究进展

1．2．1 METTL3的基因分子结构

1．2．2 METTL3的基因功能

1．2．3 METTL3的调控机理

1．3 氨酰tRNA合成酶的相关研究

1．3．1 氨酰tRNA合成酶的结构与功能

1．3．2 氨酰tRNA合成酶的非经典功能

1．3．3 甘氨酰tRNA合成酶的非经典功能

1．4 实验目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验动物细胞与载体

2．1．4 试剂的配制

2．2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定

2．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化

2．2．2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

2．2．3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏

2．3 奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

2．3．1 过表达METTL3的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

2．3．2 添加蛋氨酸、雌激素的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

2．3．3 抑制METTL3的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

2．3．5 过表达GlyRS抑制METTL3的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

2．4 IF检测不同泌乳模型中METTL3蛋白的表达与定位

2．6．2 Co-IP分析METTL3与GlyRS的相互作用

2．7 数据分析

3 结果与分析

3．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

3．1．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化

3．1．2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

3．2 过表达METL3后乳蛋白和乳脂合成相关信号分子的表达变化与METTL3的定位变化

3．2．1 METTL3过表达载体的构建

3．2．2 真核表达载体pGCMV-IRES-EGFP-METTL3的瞬时转染

3．2．3 IF检测过表达METL3后METTL3的表达与定位

3．2．4 Western blotting检测过表达METL3后乳蛋白和乳脂肪合成相关信号分子的表达

3．3 添加蛋氨酸、雌激素后乳蛋白和乳脂合成相关信号分子的表达变化与METTL3的定位变化

3．3．1 添加蛋氨酸和雌激素的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立

3．3．2 IF检测添加蛋氨酸、雌激素后METTL3的表达与定位

3．3．3 Western blotting检测添加蛋氨酸、雌激素后乳蛋白和乳脂肪合成相关信号分子的表达

3．4 METTL3抑制对乳蛋白和乳脂合成相关信号分子表达与METTL3定位的影响

3．4．1 METTL3干扰片段的筛选

3．4．2 IF检测METL3抑制后METTL3的表达与定位

3．4．3 Western blotting检测METL3抑制后乳蛋白和乳脂肪合成相关信号分子的表达

3．5 Co-IP分析METTL3与GlyRS的相互作用

3．6 GlyRS抑制对乳蛋白和乳脂合成相关信号分子表达的影响

3．7．1 GlyRS过表达载体的构建

3．7．2 Western blotting检测过表达GIyRS抑制METTL3后对乳蛋白和乳脂合成相关信号分子表达的影响

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

4．2 METTL3对乳蛋白、乳脂肪合成的调节机理

4．3 蛋氨酸、雌激素对METTL3的亚细胞定位

4．4 GlyRS介导蛋氨酸、雌激素对METTL3的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文