肿瘤相关巨噬细胞对STAT3激活及促进食管鳞癌浸润、转移的影响

摘要

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，其中以食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多见。中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，其死亡率在恶性肿瘤中居第四位，5年生存率仅为10％～25％。而肿瘤的侵袭和转移是导致总体治疗效果欠佳，远期生存率低的主要原因。　　肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是指肿瘤组织局部肿瘤细胞生长的内环境，又称肿瘤间质（tumor stroma）。肿瘤间质中的巨噬细胞通常表达M2表型，与肿瘤密切相关,被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs），是TME中数量最多的免疫细胞，可以分泌多种细胞因子,刺激特定的信号通路，在促进肿瘤侵袭、血管生成、基质重塑、转移及肿瘤免疫抑制、放化疗抵抗等方面具有重要作用。细胞因子可激活肿瘤细胞的多种信号转导通路，并调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。　　信号转导与转录激活因子3（signal tranducer and activator of transcription3,STAT3）是介导细胞间信号转导的重要转录因子，参与细胞分化、免疫应答、胚胎发育等多种生理过程。STAT3是一种转录激活剂，也是一种致癌基因。大量研究显示，STAT3在多种癌细胞系中均有异常活化。STAT3的激活与肿瘤增殖、凋亡、侵袭、转移和放化疗的抵抗有关；同时，STAT3也是癌症和炎症之间的一个重要联系，导致促癌和抗肿瘤的免疫反应。近来有研究发现，STAT3通路是细胞因子激活相关的主要通路之一，在胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、骨髓瘤等多种肿瘤中，TAMs的浸润均与STAT3活化有关，且肿瘤间质中的TAMs浸润数量与患者的生存期和预后密切相关。　　但截至目前，关于食管鳞癌中TAMs是否对STAT3激活进而促进肿瘤浸润、转移发挥作用尚不清楚。　　第一部分 CD163、CD206、STAT3和p-STAT3在人食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义　　目的：　　探讨TAMs与STAT3活化的相关性以及对食管鳞癌浸润、转移的影响。　　方法：　　1．采用免疫组织化学SP法检测100例人食管鳞癌组织及癌旁正常组织中TAMs表面标记分子CD163、CD206（分别标记TAMs）的表达情况及STAT3蛋白和其活化形式p-STAT3蛋白的表达情况。　　2．通过CD163、CD206蛋白的表达，分析TAMs的数量(将所有病例的计数值取平均值作为标准,大于平均值为高表达,小于平均值为低表达。CD163+细胞平均值：16.62±5.34个/HP;CD206+细胞平均值：17.59±4.67个/HP)与STAT3、p-STAT3的相关性以及TAMs、STAT3、p-STAT3与临床病理特征的关系。　　3.CD163、CD206两种方法标记TAMs的比较。　　结果：　　1.人食管鳞癌间质中CD163+细胞、CD206+细胞即TAMs的数量较癌旁正常组织间质明显升高(P＜0.01)；STAT3、p-STAT3在人食管鳞癌组织较癌旁正常组织中的表达显著增高(P＜0.01)。　　2.人食管鳞癌间质中，CD163+细胞、CD206+细胞即TAMs的数量与肿瘤浸润深度(P＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.01)及TNM分期(P＜0.05)呈正相关，而与性别、年龄及肿瘤组织学分级无关(P＞0.05)；人食管鳞癌组织中，STAT3蛋白表达与肿瘤浸润深度(P＜0.05)、组织学分级(P＜0.05)及TNM分期（P＜0.01）呈正相关，而与性别、年龄及淋巴结转移无关(P＞0.05)；p-STAT3蛋白表达与肿瘤浸润深度（P＜0.05）、淋巴结转移(P＜0.01)及TNM分期（P＜0.01）呈正相关，而与性别、年龄及肿瘤组织学分级无关(P＞0.05)。　　3.人食管鳞癌间质中CD163+细胞、CD206+细胞即TAMs的数量与癌细胞中STAT3表达均呈正相关（P＜0.05）；与p-STAT3表达均呈正相关（P＜0.01）。　　4.100例病例中CD163高表达84例，CD206高表达82例，共同高表达77例，共同低表达11例，一致率为88%。　　第二部分 肿瘤相关巨噬细胞对STAT3激活及食管鳞癌细胞侵袭力的影响　　目的：　　探讨TAMs对STAT3激活及促进食管鳞癌细胞侵袭力的影响　　方法：　　1.肿瘤相关巨噬细胞模型的建立　　人单核细胞（THP-1）采用佛波酯（PMA）分别联合白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）诱导分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。　　采用倒置显微镜观察细胞形态学改变。　　采用RT-PCR检测TAMs表面分子标记CD163和CD206的表达变化，验证TAMs是否诱导成功。　　2.细胞共培养　　实验细胞分为三组进行细胞培养：　　空白组：食管鳞癌细胞EC9706单独培养，设为空白组。　　共培养组：将CM（条件培养基，本文指TAMs培养上清液）与食管鳞癌细胞EC9706共培养48h。　　共培养加阻断剂组：共培养组中加入JAK2/STAT3通路特异性阻断剂AG490阻断STAT3信号通路。　　3.TAMs对人食管鳞癌细胞STAT3表达的影响　　采用Western-Blot及RT-PCR法分别检测空白组、共培养组及共培养加阻断剂组细胞中STAT3和p-STAT3的表达变化。明确TAMs是否对STAT3具有激活作用。　　4.TAMs对人食管鳞癌细胞侵袭、迁移能力的影响　　采用Transwell侵袭实验及划痕实验分别检测空白组、共培养组及共培养加阻断剂组细胞侵袭、迁移能力的变化。明确TAMs是否通过激活STAT3途径进而促进食管鳞癌细胞迁移、侵袭。　　结果：　　1．肿瘤相关巨噬细胞模型的检验　　倒置显微镜观察细胞形态：THP-1诱导分化后，细胞形态发生明显改变。正常THP-1细胞形态均一圆形、折光性好，为单个细胞悬浮生长，定向诱导分化为TAMs后，细胞呈多边形，有伪足，体积有所增加，成簇贴壁生长。　　RT-PCR检测结果显示：THP-1经PMA分别联合IL-4、IL-6诱导分化后，细胞表面TAMs特异分子标记CD163mRNA、CD206mRNA的表达水平与THP-1相比，均显著升高（P＜0.05），提示TAMs诱导成功；PMA联合IL-6诱导的TAMs较PMA联合IL-4诱导的TAMsCD163mRNA表达水平明显增高（P＜0.05），但CD206mRNA表达水平无明显差异（P＞0.05）。　　2．TAMs对人食管鳞癌细胞STAT3表达的影响　　RT-PCR结果显示：共培养组与空白组相比，STAT3mRNA明显升高（P＜0.05）；共培养加阻断剂组与共培养组相比，STAT3mRNA表达明显降低（P＜0.05）。　　Western-Blot结果显示：共培养组较空白组相比，STAT3蛋白、p-STAT3蛋白表达均明显升高（P＜0.05）；共培养加阻断剂组与共培养组相比，STAT3蛋白无明显改变（P＞0.05），p-STAT3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。　　3．TAMs对人食管鳞癌细胞侵袭、迁移能力的影响　　细胞侵袭实验和划痕实验结果显示：共培养组较空白组细胞侵袭能力和迁移能力明显增强（P＜0.05）；共培养加阻断剂组与共培养组相比，侵袭能力及迁移能力明显降低（P＜0.05）。　　结论：　　1.食管鳞癌间质中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）数目的增多对STAT3信号通路具有激活作用，进而促进食管鳞癌的浸润、转移。　　2.佛波酯(PMA)联合IL-4及联合IL-6均对人单核细胞THP-1具有诱导分化为TAMs的作用。且联合IL-6诱导的TAMs，其更高的表达CD163。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分 CD163、CD206、STAT3和p-STAT3在人食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计方法

2 实验结果

2.1 TAMs在食管鳞癌组织间质中的计数

2.2 STAT3在食管鳞癌组织中的表达

2.3 p-STAT3蛋白在食管鳞癌组织中的表达

2.4 人食管鳞癌间质中TAMs数量与癌细胞中STAT3、p-STAT3表达的相关性

2.5 CD163、CD206两种方法标记TAMs的比较

3 讨论

4 小结

第二部分 肿瘤相关巨噬细胞对STAT3激活及食管鳞癌细胞侵袭力的影响

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计方法

2 结果

2.1 TAMs模型的构建

2.2 TAMs培养上清液（CM）对食管鳞癌细胞STAT3及其活化的影响

2.3 TAMs培养上清液（CM）对食管鳞癌细胞侵袭、迁移能力的影响

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

综述:肿瘤间质中肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的研究进展

参考文献

个人简历

致谢