不明原因复发性流产与叶酸代谢相关基因多态性及血清HCY、叶酸的关系

摘要

背景和目的:　　复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是一种复杂的疾病。尽管国内将其定义为发生3次及以上的妊娠丢失，但多数专家认为发生2次自然流产者即应给予重视并进行评估，因其再次发生自然流产的可能与3次者相近。而且美国生殖医学协会将RSA定义为2次或2次以上发生在20周之内的妊娠失败，其中早期流产发生在妊娠12周之前，晚期流产发生在妊娠12～20周。RSA在育龄期女性中的发生率为3％～5％，而RSA患者再次妊娠的自然流产发生率高达70％～80％。RSA病因复杂多样，除遗传、解剖异常、内分泌紊乱、感染、自身免疫、精子质量、生活方式、精神心理及环境等因素外，仍有50％～75％的RSA仍病因不明，称为不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。　　大量研究表明URSA与基因多态性有关，如:PAI-1、FVL、FII、MTHFR、MTRR等，较受关注的是MTHFR、MTRR。有人提出，MTHFR A1298C和C677T、MTRR A66G这两种多态性的突变可能影响亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶的活性，并影响同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)的代谢，从而导致高同型半胱氨酸血症和血栓形成倾向。高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤，导致血栓形成，而胎盘动脉栓塞所致的胚胎血供不足、绒毛坏死，最终可导致流产发生。　　URSA的复发风险随着流产次数的增加而上升，给家庭及社会带来严重的影响，但目前临床上缺乏有效预测URSA发生的指标。目前许多研究认为URSA的发生与血栓前状态有关，约50％-65％的RSA患者被诊断为血栓前状态，而血清HCY升高可导致血栓形成，而叶酸(folic acid，FA)作为HCY代谢中的重要原料，孕妇体内缺乏后也可导致高同型半胱氨酸血症，从而导致流产。　　尽管已有研究报道了MTHFR A1298C和C677T、MTRR A66G多态性与URSA的关系，但是结果并不一致。本研究采用更大的样本量进一步研究MTHFR和MTRR基因多态性与URSA的关系，期望发现URSA的遗传风险因素;通过对不明原因复发性流产孕妇及同期正常孕妇血清中HCY、叶酸的水平进行检测，旨在探讨孕妇血清中HCY、叶酸在预测URSA发生中的价值，为URSA的预防和治疗提供新的依据。　　资料和方法:　　1.研究对象和分组　　1.1 选取2016年9月-2018年2月于郑州大学第三附属医院进行围产保健的URSA患者218例，对照组264例，统计其一般临床资料（民族、吸烟、饮酒、孕前体质指数）并检测其MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的序列。　　1.1.1 入组标准:对照组:至少有过一次正常妊娠，且无自然流产病史;URSA组:有2次及2次以上的自然流产病史（且被诊断为复发性流产）。　　1.1.2 排除标准:经妇科检查、B超、子宫输卵管造影等检查确诊生殖器解剖学畸形;妊娠早期服用致畸药物史;夫妇双方及胚胎染色体出现异常;胃肠手术史及严重的肝肾功能不全、消化系统疾病病史;糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、甲状腺疾病、免疫系统或血液系统疾病史;生殖道病原微生物感染。　　1.2 选择2018年1月-2018年12月在本院检查的不明原因复发性流产孕妇120例（URSA组），包括早期流产组（＜12周，60例）、晚期流产组(12～20周，60例)，连续2次自然流产者90例，连续3次及以上自然流产者30例;同期常规围产保健的孕妇140例（对照组）汉族妇女，统计其一般临床资料（民族、吸烟、饮酒、孕前体质指数）并检测血清HCY、叶酸水平。　　入组标准、排除标准同1.1.1和1.1.2.　　本研究已获得郑州大学第三附属医院医学伦理委员会的批准，所有参与者均已签署知情同意书。　　2.取样及检测方法　　2.1 受检者漱口后，利用拭子在其一侧口腔颊粘膜反复刷取数次，收集218例URSA患者和264例对照妇女的口腔粘膜上皮的脱落细胞，利用荧光定量PCR技术检测其MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的序列.　　2.2 采集120例有自然流产史且本次不明原因自然流产患者和140例对照组妇女的空腹静脉血，利用化学发光法测定血清叶酸水平，循环酶法测定血清HCY水平。　　3.统计学方法　　采用SPSS21.0软件进行统计学分析，定性资料（如民族频率、吸烟饮酒率等）采用x2检验、Fisher精确检验;所有计量资料正态分布则采用(x)±s表示，非正态分布则采用中位数(M)和四分位数(IQR)表示，组间独立样本的比较采用t检验、校正t检验及秩和检验。统计482例妇女样本的基因型频数，对其进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，采用x2检验（n≥40和期望值≥5）和Fisher精确检验（n＜40或期望值＜1）分析样本中基因各位点的基因型和等位基因的分布，计算比值比(OR)并在95％置信区间(95％CI)内呈现。用特异度和灵敏度检验预测URSA的价值，再应用受试者工作特征(ROC)曲线及约登指数评判每个血清指标的预测价值，并确定相应的预测界值。最后根据各单项血清指标的预测界值通过logistic方程建立联合预测因子，以联合预测因子作为检验变量，以是否为URSA作为状态变量绘制ROC曲线，并计算约登指数。以P＜0.05认为差异有统计学意义。　　结果:　　1.不明原因复发性流产与叶酸代谢相关基因多态性的关系　　1.1 URSA组妇女叶酸代谢障碍人群明显高于对照组(P=0.041)，差异有统计学意义，且有风险者中高风险患者最多。　　1.2 URSA组妇女的MTHFR C677T位点T等位基因频率显著高于对照组(OR=1.324,95％CI1.014-1,729,P=0.039)，且CC+CT基因型在URSA组中表达显著降低(OR=0.678,95％CI0.471-0.974,P=0.035);URSA组患者MTHFR1298位点C等位基因频率显著高于对照组(OR=1.557,95％CI1.066-2.275,P=0.021),且AC和AC+CC基因型在URSA组中的表达均高于对照组(OR=1.820,95％CI1.169-2.834,P=0.008;OR=1.740,95％CI1.137-2.661,P=0,010)，差异有统计学意义;URSA组MTRR A66G位点AG和AG+GG基因型频率均高于对照组(OR=1.512,95％CI1.047-2.185,P=0.027;OR=1.469,95％CI1.024-2.107,P=0.036)，差异有统计学意义。　　1.3 URSA组中MTHFR677CT/1298AC复合基因型频率是对照组的6.589倍(P=0.001);URSA组患者携带2个突变基因者最多(69.3％)，且明显高于对照组(OR=4.996,95％CI1.650-15.129,P=0.002)。　　2.妊娠期妇女血清HCY、叶酸水平及联合预测不明原因复发性流产发生的价值　　2.1 自然流产2次、≥3次患者分别与对照组相比，年龄、血清HCY水平差异均有统计学意义(P＜0.05)，且随流产次数增加，血清HCY水平呈上升趋势;自然流产≥3次者比自然流产2次者发生更早，两者相比差异有统计学意义(P=0.000).　　2.2 早期URSA组与早期对照组孕妇的年龄(33.50(31.00-36.00)vs28.00(28.00-30.00)岁，P=0.000)、血清HCY(7.50(6.90-8.50)vs6.50(5.60-6.90)μmol/L，P=0.000)、叶酸水平(30.86(25.57-42.48)vs23.14(15.81-24.00)nmol/L，P=0.000)相比，差异有统计学意义;晚期URSA组与晚期对照组孕妇年龄（32.10±5.60vs28.78±4.24岁，P=0.000）、血清叶酸水平(19.46(15.45-33.40)vs34.96(20.40-41.90)nmol/L，P=0.001)相比，差异有统计学意义;　　2.3 分别以HCY+FA、HCY+年龄、FA+年龄、HCY+FA+年龄的联合预测因子作为检验变量绘制ROC曲线并计算约登指数，在各自的预测界值下，曲线下面积分别为0.672、0.783、0.770、0.782，约登指数分别为0.348、0.533、0.571、0.533。　　结论:　　1.MTHFR C677T和A1298C、MTRR A66G位点基因突变是URSA发生的危险因素。　　2.孕妇血清FA水平联合年龄对URSA的发生具有更高的预测价值。

目录

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摘要

中英文缩略词表

第一部分不明原因复发性流产与叶酸代谢相关基因多态性的关系

1 引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

第二部分妊娠期孕妇血清HCY、叶酸水平及联合预测不明原因复发性流产发生的价值

1 引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

展望

综述 不明原因复发性流产预测的进展

个人简历、在校期间发表的学术论文和研究成果

致谢