Med19在皮肤黑色素瘤组织中的表达及其对A375细胞生物学行为的影响

摘要

背景：　　黑色素瘤（Malignant melanoma,MM）,是来源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤，常见于皮肤和其他器官黏膜，早期即可发生局部和远处转移，恶性程度高，进展迅速，总体中位生存期仅7.5个月，预后差，病死率高。近年来，其发病率在世界各地都呈上升趋势，成为排在首位的皮肤致死类疾病，且根据流行病学调查，我国皮肤黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）的发病率及死亡率也呈上升趋势。在治疗上，目前主要是靠手术切除为主，术后辅以放化疗等治疗措施，分子靶向治疗等也在临床上应用来尝试改善患者的生存期，且关于黑色素瘤基础和临床研究的探索不断增多，但其发病机制仍然未明，也缺乏早期的诊断方法，很多患者确诊时已经是中晚期。临床治疗上无显著进展，现状仍不容乐观。因此，进一步探索黑色素瘤发生和发展的相关机制，寻找新的肿瘤标志物以及治疗靶点，为进一步提高黑色素瘤的早期诊断、治疗，监测其复发、转移，是目前基础研究的方向与目标之一。　　中介因子复合体（Mediator,Med）是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子结构复合物，已证实有促进细胞外转录的激活、增强基础转录、促进CTD（聚合酶大亚基羟基端结构域carboxy terminal domain）磷酸化的功能，在调节细胞生长、分化和凋亡的各个过程中直接或间接发挥着作用。中介体复合物亚基19（Mediator19,Med19）是其一个亚基，位于染色体上11q12.1位置，在人类编码的基因名为LCMR1（肺癌转移相关蛋白，Geb Bank编号AAN16075），相关研究表明，Med19在肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种人类肿瘤中表达增高，涉及到多种肿瘤的形成及发展过程。　　改变细胞中某种蛋白的表达量，是研究该蛋白在细胞中作用的常用科研思路。既往关于Med19基因在恶性肿瘤恶性生物学行为，如增殖、凋亡、分化、侵袭方面的研究，为肿瘤的基因治疗提供了一条新的治疗思维。RNAi干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，被大量运用于探索基因功能、传染性疾病、恶性肿瘤的治疗。国内外已有大量研究证明利用RNAi技术沉默Med19基因抑制人乳腺癌细胞、人肺癌A549细胞等肿瘤细胞以探明干扰后对其增殖、凋亡、侵袭、转移等的影响，为这些恶性肿瘤的治疗提供了新的治疗思路。而关于Med19基因与皮肤黑色素瘤的相关研究，目前未见相关报道。因此，本研究旨在通过免疫组织化学方法,检测Med19在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的不同表达，并研究其表达水平与黑色素瘤恶性表型的相关性；应用Med19 siRNA转染黑色素瘤A375细胞后，通过RT-PCR方法检测Med19 mRNA在A375细胞中的表达水平，并利用MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡，探讨其与皮肤黑色素瘤发生的相关性。　　第一部分 Med19在皮肤黑色素瘤组织中的表达及意义　　目的：　　研究Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的表达，并分析其与患者临床参数的相关性。　　方法：　　1.应用免疫组织化学方法检测Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中的表达。　　2.应用统计学方法对Med19蛋白的表达量与患者临床参数进行综合分析。　　结果：　　1.应用免疫组化检测52例皮肤黑色素瘤和20例癌周正常组织中Med19蛋白表达情况，结果显示：52例皮肤黑色素瘤组织中的Med19阳性蛋白表达86.54%（45例），而20例癌周组织中Med19蛋白阳性表达为15.0%（3例），差异有统计学意义（P<0.05）。　　2.Med19蛋白在皮肤黑色素瘤组织中的表达水平高于癌周正常组织，且在发生淋巴结转移、TNM分期较晚的患者组织中的表达高于未发生转移、TNM分期较早的患者，差异具有显著性（P＜0.05）。与患者年龄、性别、原发灶溃疡有无等无显著相关性（P>0.05）。在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达水平高于癌周正常组织，差异具有显著性（P＜0.05）。　　结论：　　1.在皮肤黑色素瘤组织中Med19蛋白表达较癌周正常组织明显上调，提示Med19可能参与了皮肤黑色素瘤的发生发展。　　2.Med19在皮肤黑色素瘤表达在发生淋巴结转移、TNM分期较晚的患者组织中的高于未发生转移、TNM分期较早的患者（P<0.05）,差异具有统计学意义，提示Med19可能与黑色素瘤的生物学行为有关。　　第二部分 Med19表达对黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响　　目的：　　在第一部分实验中，观察到Med19皮肤黑色素瘤组织、癌周正常组织中均有表达，且皮肤黑色素瘤组织中Med19蛋白表达较癌周正常组织明显上调，统计分析证实表达量与淋巴结转移、TNM分期呈正相关，而与患者性别、年龄等无关，提示Med19可能与黑色素瘤的生物学行为相关。本部分拟通过 siRNA沉默A375细胞中Med19基因，应用RT-PCR检测Med19 mRNA的表达，并通过MTT、细胞凋亡实验，观察沉默Med19基因对黑色素瘤A375细胞增殖、凋亡的生物学行为的影响。　　方法：　　1.通过siRNA沉默Med19表达，应用RT-PCR检测黑色素瘤A375细胞Med19 mRNA的表达水平。　　2.通过增殖实验检测Med19沉默对黑色素瘤A375细胞增殖的影响。　　3.通过流式细胞术检测Med19沉默对黑色素瘤A375细胞凋亡的影响。　　结果：　　1.A375细胞siRNA转染后可抑制Med19基因mRNA的表达。　　2.Med19基因沉默对黑色素瘤A375细胞的增殖具有显著性抑制作用。　　3.Med19基因沉默可引起黑色素瘤A375细胞明显的凋亡。　　结论：　　siRNA可有效沉默黑色素瘤A375细胞Med19基因的表达，沉默Med19基因可以明显诱导A375肿瘤细胞凋亡，抑制其生长，细胞增殖能力减弱,表明Med19参与了黑色素瘤发生、发展的不同时期，有望成为黑色素瘤临床诊断、分期的重要依据，并可作为新的肿瘤治疗靶点。

目录

声明

缩略词表

第一部分 Med19在皮肤黑色素瘤组织中的表达及意义

1 绪论

2 材料方法

3 结果

4 讨论

第二部分 Med19表达对黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响

1 绪论

2 材料方法

3 结 果

4 讨论

结论

综述: 黑色素瘤及Med19基因在恶性肿瘤中的研究进展

个人简历、在校期间发表的论文

致谢