AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞调控的研究

摘要

近视是一种最常见的世界性眼科疾病，在欧美，大约有三分之一的美国成年人患有不同程度的近视[1]，随着经济的发展，在一些亚洲国家，近视的患病率逐渐增高且近年来有逐渐超过欧美西方国家的趋势[2]。作为结缔组织，巩膜由成纤维细胞以及胶原蛋白组成，巩膜成纤维细胞及胶原成分在眼球正常生长发育过程以及近视发生过程巩膜重塑中发挥极其重要的作用。巩膜成纤维细胞参与巩膜重塑过程，在巩膜组织结构和生物学特性方面起到重要作用，当发生近视后，患者巩膜成纤维细胞减少，胶原纤维变细，巩膜变薄。近年来多项研究表明，在近视发生发展过程中，成纤维细胞中胶原蛋白水平的变化对巩膜重塑起着重要作用[3-5]。由此，对巩膜成纤维细胞数量及胶原蛋白含量在近视发生发展过程中的变化加以研究，从而进一步发现新型药物以抑制近视发展对于近视的治疗意义重大。　　在近视患者中，为了有效抑制近视的发展，经过较大量的临床观察以及实验研究证实，选择性M1受体拮抗剂哌仑西平和非选择性M受体拮抗剂阿托品在抑制近视发生发展方面疗效确切并在临床中得到广泛的应用[6]。M1-M5五种M受体亚型在鼠、人眼巩膜组织中均有表达[7]，抑制近视药物不仅仅局限于非选择M受体拮抗剂及M1受体拮抗剂，除了阿托品和哌仑西平外，选择性M4受体拮抗剂也可作用于巩膜成纤维细胞和巩膜胶原蛋白从而延缓近视发生发展进程，同时发现，M2受体在近视过程中也可起到相应的作用[14]。此次实验选取人胚胎眼巩膜成纤维细胞，对该细胞中M2受体是否表达进行检测，同时观察经选择性M2受体拮抗剂AFDX-116作用于细胞后，M2受体的表达量、细胞增殖的数量以及I型胶原合成量所发生的变化。探讨人胚胎眼巩膜成纤维细胞细胞M2受体在近视发生发展过程中的作用以及其选择性拮抗剂AFDX-116在近视发生发展过程中所起的作用和作用机制。　　目的：　　检测人胚胎眼巩膜成纤维细胞(humanfetalscleralfibroblasts，HFSFs)中毒蕈碱乙酰胆碱能M2受体的表达，观察经AFDX-116药物刺激后，M2受体在细胞的表达量、巩膜细胞数量以及I型胶原蛋白合成量的变化，探讨AFDX-116在近视过程当中所起的作用及作用机制。　　方法：　　取5-7代HFSFs，分为两组，实验组:接受AFDX-116刺激，培养液中药物终浓度分别为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L，对照组:不接受药物刺激，仅加入等体积的培养液。M2受体mRNA在对照组及实验组表达量由逆转录-聚合酶链反应(ReversTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)法进行检测;CCK8(CellCountingKit-8)法检测对照组及实验组HFSFs增殖变化情况，于酶标仪450nm检测吸光值(OD值);免疫荧光(Immunofluorescence，IF)法对对照组及实验组HFSFsI型胶原蛋白(COL1A1)在细胞中的表达进行观察。　　结果：　　1.M2受体mRNA在HFSFs的表达及变化　　对照组HFSFs可检测到M2受体mRNA的表达，其相对表达量为0.372±0.022，实验组HFSFs在AFDX-1161μmol/L(0.418±0.007)、10μmol/L(0.579±0.035)、100μmol/L(0.768±0.042)浓度下，其M2受体mRNA相对表达量有所增高，与对照组相比，差异具统计学意义(P=0.029、0.001、0.000);在AFDX-1160.1μmol/L(0.391±0.018)浓度下M2受体mRNA相对表达量未观察到明显变化，与对照组相比，差异无统计学意义(P=0.327)。　　2.HFSFs增殖变化　　对照组HFSFsOD值为0.820±0.048，实验组HFSFs在AFDX-1161μmol/L（0.725±0.078）、10μmol/L（0.690±0.053）、100μmol/L（0.612±0.042）浓度下OD值均有不同程度的降低，差异较对照组有统计学意义(P=0.049、0.004、0.000);在AFDX-1160.1μmol/L(0.802±0.078)浓度下OD值仅轻度下降，较对照组差异无统计学意义(P=0.745)。　　3.COL1A1表达变化　　IF结果显示AFDX-116可促进HFSFsCOL1A1分泌，对照组HFSFs可检测到COL1A1表达,实验组HFSFs在AFDX-1160.1μmol/L浓度下未观察到明显的COL1A1分泌增多，在AFDX-1161μmol/L、10μmol/L、100μmol/L浓度下COL1A1表达较对照组可观察到不同程度的增加。　　结论：　　1.M2受体在体外培养的人胚胎眼巩膜成纤维细胞中可检测到稳定表达。　　2.选择性M2受体拮抗剂AFDX-116在促进人胚胎眼巩膜成纤维细胞M2受体表达、抑制细胞增殖、促进I型胶原蛋白表达方面可发挥显著作用。　　3.M2受体可能参与了近视的发生发展过程。

目录

声明

摘要

英文缩写一览表

引言

材料和方法

1 材料

2 HFSFs的体外培养

3 RT-PCR检测HFSFs M2受体mRNA的表达以及AFDX-116对其表达的影响

4 CCK8法检测AFDX-116对HFSFs增殖影响

5 IF观察AFDX-116对HFSFs中COL1A1表达的影响

6 统计学分析

结果

1 M2受体mRNA表达及变化

2 HFSFs增殖情况及变化

3 COL1A1表达及变化

讨论

1 巩膜与近视的关系

2 AFDX-116对M2受体表达的影响

3 AFDX-116对细胞增殖的影响

4 AFDX-116对Ⅰ型胶原合成的影响

结论

附图

参考文献

综述 视网膜乙酰胆碱能递质系统与近视的关系及研究进展

个人简历及在校期间发表的学术论文

致谢