胎盘间充质干细胞联合外周血造血干细胞移植对SCID小鼠造血的影响

摘要

研究背景及目的：　　 外周血造血干细胞移植(Peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)是目前治疗多种实体瘤和恶性血液病的有效方法。PBSCT的原理主要是用来源于外周血中的造血干/祖细胞重建患者的免疫和造血功能。PBSCT与传统的骨髓移植相比较,有如下优点:移植后患者免疫恢复早,造血重建快,出血、感染机会少,成分输血和抗生素的应用减少,移植后死亡率低;采集PBSC方便,避免穿刺引起的痛苦;多发性骨髓瘤和侵犯骨髓的患者,肿瘤细胞浸润骨髓、骨质破坏、骨盆局部放疗无法采集骨髓,可采集PBSC代替;和骨髓相比较,外周血中的肿瘤细胞混入较少,移植后复发率相对较低;PBSCT后的免疫功能重建较早,且回输了大量的T细胞、NK细胞和单核细胞,理论上有可能移植物抗肿瘤细胞效应在移植后得到增强,能够清除残留的病灶,减少其复发。近年来,PBSCT逐渐替代了骨髓造血干细胞的移植。　　 通常认为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能干细胞,具有增殖和分化潜能,可以分化为中胚层和外胚层的细胞,其中包括软骨细胞,骨细胞,肌细胞,成纤维细胞和血管内皮细胞,也有可能分化为神经元及神经胶质细胞等。可以作为造血微环境的一种主要细胞成分(骨髓基质的前体细胞),它在造血调控中起着重要的作用,对血细胞的发育、生成具有非常重要的调节和支持作用,能下调免疫反应,使移植物抗宿主病(GVHD)很少发生。其中,骨髓来源的MSC的应用更加广泛。但是MSC在骨髓和外周血等组织中的含量极低,仅仅占到骨髓细胞的1/104～1/105。并且有研究表明随着年龄的增长骨髓中的MSC含量会逐步降低,同时由于其伴有细胞增殖分化能力的大大降低,所以其应用受到一定的限制。　　 近些年来,通过研究发现了胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stemcells,PMSC)较骨髓具有多个方面的优势,取材不受限,胎儿只要娩出,胎盘就成为废物,只要产妇同意,都可以提供胎盘;污染机会少,供者无痛苦;不受道德和伦理的约束;所以对捐献者没有任何伤害。人胎盘MSC免疫原性较低,可通过MHC屏障,在免疫调节、造血及细胞归巢植入等方面起着非常重要的作用。　　 张毅等通过实验说明,胎盘MSC对造血干细胞的体外扩增和支持作用比较肯定。HSC移植(HSCT)成功的必需条件是足够量的HSC/HPC。如果HSC的数量少,患者的无髓期将变长,使移植失败几率增高,危急患者的生命。所以现在越来越重视HSC在体外的扩增。　　 本课题组通过前期研究的结果显示:胎盘间充质干细胞具有体外造血支持作用,其可为造血干细胞提供造血的微环境,抑制其分化,促进其扩增。用作脐血,骨髓,胎盘等来源造血干细胞在体外扩增的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞的效果最好。　　 本实验是在前期研究胎盘间充质干细胞在体外对不同来源造血干细胞体外扩增支持作用比较的基础上探讨人胎盘问充质干细胞对外周血造血干细胞在scid小鼠体内造血重建的影响。材料:　　 1.胎盘:正常新鲜健康的胎盘组织来源于郑州大学第一附属医院产科。　　 2.外周血造血干细胞:外周血造血干细胞来源于郑州大学第一附属医院移植科造血干细胞捐献者。　　 3.Scid小鼠:8-10周龄雄性scid小鼠购于北京华阜康生物科技股份公司。　　 4.主要试剂:胎牛血清、DMEM培养基、PBS液均购于美国Hyclone公司,红细胞裂解液购于Sigma公司,胶原酶Ⅳ购于Solarbio公司,胰蛋白酶消化液购于北京。　　 5.细胞因子和抗体:单克隆抗体抗CD44、CD45、CD105、CD19、CD29、CD34、CD106、HLA-DR、HLA-ABC及UEA-1均购于PharMingen公司。　　 方法：　　 1.胎盘间充质干细胞的分离培养及鉴定:在无菌条件下取胎盘组织,用Ⅳ型胶原酶消化,用100目不锈钢筛网过滤,获得的细胞悬液接种含10-20％胎牛血清的培养瓶中,37℃、5%CO2孵育箱内培养,48-72h后换液去除未贴壁细胞,继续培养,每3天全量换液一次,细胞按贴壁细胞的常规方法传代。取第3代以后的细胞,然后分别加入PE或FITC标记的鼠抗人单克隆抗体,流式细胞仪检测细胞表型。　　 2.外周血造血干细胞的分离:通过人类粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血造血干细胞捐献者,第5天开始采集。此时我们通过外周静脉单采术而获得PBSC,所采的干细胞和粒细胞通过离心与红细胞和血浆等成分分离,将分离的血浆和红细胞回输给供者,完成一次采集的时间为3～5h。一般通过1～2次采集后,可获得PBSC数目为2×106个细胞/kg,达到实验的需求。　　 3.动物实验:移植分为三组:A组为生理盐水对照组,B组为外周血造血干细胞移植组,C组为胎盘问充质干细胞与外周血造血干细胞联合移植组。移植后每天观察scid小鼠一般状况,移植后第7、10、14、21、28天细胞计数仪监测白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)水平;移植后28天分别处死实验小鼠,取其股骨骨髓细胞,制成细胞悬液,然后用CD34、CD45单抗标记,通过流式分析。　　 4.统计分析根据数据资料类型,采用两组独立样本的t检验,判断结果有无统计学的意义。　　 结果：　　 1.本实验证实了胎盘中存在着间充质干细胞。　　 2.用胎盘间充质干细胞联合外周血造血干细胞移植可以促进造血干细胞的植入,缩短造血干细胞移植后造血恢复时间,实验表明单纯造血干细胞移植组scid小鼠股骨骨髓腔内CD45+、CD34+细胞的百分比分别为5.66±60%、4.23±1.21%;联合移植组scid小鼠股骨骨髓腔内CD45+、CD34+细胞的百分比分别为36.54±1.63%、39.06±2.23%。单纯造血干细胞移植组和联合移植组scid小鼠股骨骨髓腔内CD45+细胞相比差异具有统计学意义(t=43.458,P＜0.05);单纯造血干细胞移植组和联合移植组scid小鼠股骨骨髓腔内CD34+细胞相比差异也具有统计学意义(t=34.150,P＜0.05)。　　 结论：　　 1.进一步证实了胎盘中存在间充质干细胞。　　 2.胎盘间充质干细胞联合外周血造血干细胞移植可以促进造血干细胞的植入,缩短造血干细胞移植后造血恢复时间。　　 3.胎盘可以作为间充质干细胞的来源用于造血干细胞联合移植。