淇河鲫凝集素CaNTC、CaCLR和CaGal-9基因克隆、组织表达及其免疫功能研究

摘要

淇河鲫(Qihe crucian carp，Carassius auratus)为天然三倍体鱼类，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随养殖密度增加，病害种类增多，淇河鲫免疫力明显下降，造成较大经济损失。作为低等脊椎动物，淇河鲫特异性免疫尚不完善，非特异性免疫尤为重要。开展淇河鲫非特异免疫机制研究，可有效防控鱼病发生。在鱼类非特异性免疫中，凝集素扮演着重要角色。凝集素通过介导蛋白质-碳水化合物的相互作用而成为非特异性免疫的重要组成部分，在提高机体免疫方面发挥了重要作用。弄清鱼类凝集素在非特异性免疫和抗菌中的作用，对于有效控制鱼病的发生具有重要意义。　　本研究以淇河鲫为研究对象，克隆三种凝集素基因CaNTC、CaCLR及CaGal-9，对其分子特征、组织分布、表达响应及免疫功能进行系统研究。取得主要结果如下:　　(1)淇河鲫C-型凝集素CaNTC基因克隆、组织表达及免疫功能研究　　CaNTC的cDNA全长776bp，包含5'非编码区152bp、开放阅读框492bp和3'非编码区132bp，编码163个氨基酸。氨基酸序列包含1个信号肽和1个CRD结构域。CRD中含有四个保守的半胱氨酸残基(Cys57-Cys150，Cys126-Cys142)和影响糖结合特异性的保守基序EPN-WND。　　实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同组织器官中CaNTC表达，结果显示，CaNTC在肝脏中表达量最高，头肾、脾脏、鳃和血液中次之;肾脏、皮肤、脑、肠及心脏中表达水平较低;肌肉表达量最低。其在不同组织器官中呈组成型表达，且具有明显的组织特异性。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和PolyI∶C攻毒后，淇河鲫鳃、肝、脾、肾及头肾中CaNTC呈现出明显的表达上调。　　大肠杆菌重组表达系统获得CaNTC重组蛋白(rCaNTC)，将其免疫小鼠获得多克隆抗体。在获得rCaNTC和多克隆抗体的基础上，通过ELISA检测发现rCaNTC与LPS和PGN有较强的结合能力;Western blot结果显示，rCaNTC可结合实验中所有受试细菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及溶壁微球菌)。而rCaNTC必须在Ca2+存在的情况下，才能凝集兔红细胞和3种细菌(嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)。同时在体实验发现，rCaNTC可促进淇河鲫对嗜水气单胞菌的清除。研究表明，CaNTC作为模式识别受体，可通过识别致病菌表面的糖类结构脂多糖和肽聚糖，进而结合和凝集致病菌，并可促进鱼体清除致病菌，在淇河鲫免疫防御过程中发挥重要功能。　　(2)淇河鲫C．型凝集素受体CaCLR基因克隆、组织表达及免疫功能研究　　CaCLR的cDNA全长1130bp，其中开放阅读框为792bp，编码263个氨基酸，包含1个跨膜区和1个CRD结构域。　　qRT-PCR方法检测不同组织器官中CaCLR的表达，结果显示，CaCLR在淇河鲫11种组织器官中均有表达，且头肾中表达量最高。嗜水气单胞菌和PolyI∶C攻毒后，淇河鲫鳃、肝、脾、肾及头肾中CaCLR的mRNA表达水平明显上调。采用Western blot的方法，在淇河鲫各组织中均检测到CaCLR蛋白，其中头肾和肝脏中表达量较高，脾脏、肾脏及血液次之，鳃、肠、心脏及脑中表达量较低。　　原核表达系统获得CaCLR重组蛋白(rCaCLR)，将其免疫小鼠获得多克隆抗体。rCaCLR对兔和淇河鲫红细胞及实验中的7种微生物均无凝集活性。但ELISA实验发现，rCaCLR对脂多糖、肽聚糖、β-葡聚糖及甘露聚糖4种PAMPs均具有识别和结合活性。同时Western blot结果显示，除金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌外，rCaCLR可结合其它所有受试微生物。采用抗体封闭方法检测到CaCLR可促进淇河鲫外周血白细胞对嗜水气单胞菌的吞噬作用。研究表明，CaCLR作为一种C-型凝集素受体，在致病菌侵染淇河鲫的过程中，起到模式识别受体的作用。通过识别致病菌表面的糖类结构，发挥调理素作用促进吞噬细胞对致病菌的吞噬和清除。　　(3)淇河鲫半乳糖凝集素CaGal-9基因克隆、组织表达及免疫功能研究　　CaGal-9的cDNA全长1318bp，包括5'非编码区58bp、开放阅读框963bp和3'非编码区297bp，编码320个氨基酸;预测CaGal-9蛋白结构域显示，无信号肽，无跨膜区，含2个串联的CRD结构域(CRD-1和CRD-2)。　　qRT-PCR方法检测不同组织器官中CaGal-9的表达，结果显示，CaGal-9在脾脏中表达量最高，鳃、皮肤、血液、心脏及脑中较低，肌肉中表达量最低。嗜水气单胞菌和PolyI∶C感染后，淇河鲫5种免疫相关组织中CaGal-9的mRNA表达水平明显上升。通过Western blot检测发现CaGal-9蛋白在肠中表达量最高，脾脏和肾脏次之，鳃、肝脏、头肾、心脏及脑中表达量较低。　　采用原核表达系统获得重组蛋白rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2，rCaGal-9免疫小鼠获得多克隆抗体。在无Ca2+的情况下，rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2均可凝集兔红细胞及全部受试微生物(酿酒酵母、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及溶壁微球菌)。通过糖抑制兔红细胞凝集实验可知，rCaGal-9、rCRD-1和rCRD-2均可结合半乳糖、氮乙酰半乳糖胺、乳糖、脂多糖、肽聚糖和β-葡聚糖。Western blot检测结果显示，rCaGal-9和rCRD-1结合所有的受试微生物，rCRD-2结合除枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌外的所有受试微生物。CaGal-9全长及单个结构域CRD-1或CRD-2，均具有红细胞凝集、糖识别及结合、微生物结合及凝集活性。但与单个CRD)相比，上述免疫功能，CaGal-9的活性更强，识别范围更广。　　rCaGal-9对嗜水气单胞菌和大肠杆菌具备明显的抑菌活性。在体实验发现，rCaGal-9可促进淇河鲫对嗜水气单胞菌的清除作用。嗜水气单胞菌感染后rCaGal-9可提高淇河鲫存活率。研究表明淇河鲫CaGal-9作为模式识别受体，通过识别嗜水气单胞菌表面的糖类结构，结合和凝集该致病菌，抑制其生长，并可促进淇河鲫将嗜水气单胞菌清除出体外。　　本研究根据课题组淇河鲫转录组数据，筛选出嗜水气单胞菌感染后表达明显上调的三种凝集素基因CaNTC、CaCLR及CaGal-9。采用RT-PCR和RACE技术获得cDNA全长，在mRNA和蛋白水平对这三种凝集素基因进行系统研究。结果发现它们在分子结构方面各有特点，且在病原微生物感染淇河鲫的过程中发挥各自的免疫功能。对淇河鲫三种凝集素分子特征、组织表达及识别、凝集和清除病原微生物的分子机制研究，有助于理解鱼类非特异性免疫的分子基础，对于提高鱼类免疫水平和防控疾病发生具有重要的理论意义和应用价值。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 凝集素的功能与分类

1．2 鱼类凝集素的组成、分类及功能

1．2．1 C-型凝集素

1．2．2 半乳糖凝集素

1．2．3 鼠李糖结合凝集素

1．2．4 X-型凝集素／内凝集素

1．2．5 F-型凝集素

1．2．6 正五聚体蛋白

1．2．7 钙联接蛋白和钙网织蛋白

1．3 本研究的目的及意义

第二章 淇河鲫C-型凝集素CaNTC基因克隆、组织表达及免疫功能研究

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．2 淇河鲫攻毒处理及组织取样

2．2．3 总RNA提取及cDNA合成

2．2．4 淇河鲫CaNTC的基因克隆

2．2．5 序列分析

2．2．6 CaNTC的组织分布和攻毒后组织表达分析

2．2．7 CaNTC重组表达和多克隆抗体制备

2．2．8 Western blot检测重组蛋白与抗体结合

2．2．9 CaNTC重组蛋白的凝集实验

2．2．10 糖抑制细菌凝集活性的检测

2．2．11 ELISA检测CaNTC重组蛋白与PAMPs的结合活性

2．2．12 Westem blot检测CaNTC重组蛋白与细菌的结合活性

2．2．13 CaNTC重组蛋白对免疫组织中嗜水气单胞菌的清除能力检测

2．3 结果与分析

2．3．1 淇河鲫CaNTC序列分析

2．3．2 淇河鲫CaNTC的表达分析

2．3．3 淇河鲫CaNTC重组表达及纯化

2．3．4 CaNTC重组蛋白的凝集活性

2．3．5 糖抑制 CaNTC重组蛋白对大肠杆菌的凝集活性

2．3．6 CaNTC重组蛋白与PAMPs的直接结合能力

2．3．7 CaNTC重组蛋白与细菌的结合活性

2．3．8 CaNTC重组蛋白对淇河鲫清除嗜水气单胞菌的促进作用

2．4 讨论

第三章 淇河鲫C-型凝集素受体CaCLR基因克隆、组织表达及免疫功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 实验动物

3．1．3 主要试剂

3．1．4 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 淇河鲫不同组织器官样品采集

3．2．2 淇河鲫攻毒处理及样品采集

3．2．3 总RNA提取及cDNA合成

3．2．4 淇河鲫CaCLR基因克隆

3．2．5 序列分析

3．2．6 CaCLR的组织分布和攻毒后组织表达分析

3．2．7 CaCLR蛋白重组表达及多克隆抗体制备

3．2．8 Western blot检测CaCLR重组蛋白与多克隆抗体的结合

3．2．9 CaCLR蛋白水平的组织分布

3．2．10 凝集实验

3．2．11 CaCLR重组蛋白与PAMPs的直接结合实验

3．2．12 微生物结合实验

3．2．13 CaCLR促进白细胞对嗜水气单胞菌吞噬能力的检测

3．3 结果与分析

3．3．1 淇河鲫CaCLR序列分析

3．3．2 淇河鲫CaCLR的表达分析

3．3．3 淇河鲫CaCLR的重组表达及纯化

3．3．4 Westem blot检测CaCLR蛋白的组织分布

3．3．5 CaCLR重组蛋白的凝集活性

3．3．6 CaCLR重组蛋白与PAMPs的直接结合能力

3．3．7 CaCLR重组蛋白与微生物的结合活性

3．3．8 CaCLR在白细胞吞噬嗜水气单胞菌中的作用

3．4 讨论

第四章 淇河鲫半乳糖凝集素CaGa1-9基因克隆、组织表达及免疫功能研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 实验动物

4．1．3 主要试剂

4．1．4 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 淇河鲫不同组织器官样品采集

4．2．2 淇河鲫攻毒处理及样品采集

4．2．3 总RNA提取及cDNA合成

4．2．4 淇河鲫CaGa1-9基因克隆

4．2．5 序列分析

4．2．6 组织分布和攻毒后组织表达模式分析

4．2．7 CaGa1-9全长和两个结构域蛋白重组表达及多克隆抗体制备

4．2．8 Western blot法检测重组蛋白与多克隆抗体的结合

4．2．10 凝集实验及糖的抑制凝集作用实验

4．2．11 微生物结合实验

4．2．14 CaGa1-9重组蛋白对免疫组织中嗜水气单胞菌的清除能力检测

4．3．1 淇河鲫 CaGa1-9序列分析

4．3．2 淇河鲫 CaGa1-9的表达分析

4．3．3 淇河鲫CaGa1-9及两个结构域的重组表达及纯化

4．3．4 Westem blot检测淇河鲫CaGa1-9 蛋白的组织分布

4．3．5 CaGa1-9及两个结构域重组蛋白的凝集活性

4．3．6 CaGa1-9及两个结构域重组蛋白与细菌的结合活性

4．3．8 CaGa1-9重组蛋白的抑菌活性

4．3．9 CaGa1-9重组蛋白对淇河鲫清除嗜水气单胞菌的促进作用

4．3．10 CaGa1-9重组蛋白对嗜水气单胞菌感染后淇河鲫存活率的影响

4．4 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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