大黑花云豆凝集素的分离纯化性质研究及玉竹凝集素的基因克隆研究

摘要

本研究将大黑花芸豆种子经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱、阳离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛层析得到凝集素样品。经SDS—PAGE检测显示单一蛋白带，分子量约为28kD，SephacrylS-100凝胶过滤测得其表观分子量约为56kD，表明PML是由两个相同亚基组成的蛋白。性质研究发现PML具有强的兔血细胞凝集素活性；糖抑制实验结果显示盐酸氨基葡萄糖，蔗糖对PML的凝血活性有很强的抑制作用，而麦芽糖，半乳糖和D-果糖对其活性有一定程度的抑制。295nm激发时，天然PML的最大荧光发射峰在327nm处，比游离Trp的最大荧光发射峰348nm蓝移了21nm，说明Trp周围的极性较弱，并未完全暴露于周围溶剂中。280nm激发时，其最大荧光发射峰也在327nm处，荧光强度增加，说明PML的内源荧光发生了从Tyr到Trp的能量转移。研究了不同温度、pH和变性剂对PML凝血活性的影响和荧光光谱的变化，当温度达80℃时，活性完全丧失；pH为4—9对活性影响不大，pH低于2和pH高于12时，大黑花芸豆凝集素的凝血活性大部分丧失；高温和强碱对荧光光谱有较大影响，表明PML对高温，强碱的耐受性不强。NBS修饰Trp过程中，荧光强度明显降低，最大发射波长开始并没有明显变化。计算表明大约有3个色氨酸残基位于PML分子表面，这3个色氨酸残基的修饰导致PML的凝血活性逐渐降低直至完全丧失，表明它们与PML凝血活性的维持有及其重要的作用。丙烯酰胺对PML中Trp淬灭程度达到83％，KI能淬灭PML分子中49％的Trp残基的荧光。用荧光光谱法研究了两种变性剂脲和盐酸胍在不同浓度下对PML构象和凝血活性的影响。盐酸胍较脲可产生更强的变性作用。关键词：大黑花芸豆凝集素；分离纯化；化学修饰；变性剂；荧光光谱；荧光淬灭本文采用同源克隆的方法，通过对玉竹RNA的提取，反转录成cDNA，从Genbank上比较已登录的百合科凝集素的序列，找出其保守序列，并结合软件设计了简并引物，进行3'RACE末端快速扩增，得到了3'端的部分序列，然后根据已得到的序列设计特异性引物，应用在cDNA的3'端随机添加若干PolyA的方法，在cDNA模板3'端加上PolyA，再以此为模板进行PCR，从而克隆得到了玉竹5'端的部分序列，将3'与5'序列合并，就能获得cDNA全长序列。 以获得的全长cDNA序列和推导出的氨基酸序列与百合科其他植物凝集素在进行比较，可知玉竹的全长cDNA序列由529个核苷酸组成，开放阅读框长474bp，编码157个氨基酸。通过序列的测定，发现POL基因均编码前体蛋白：含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列。该成熟蛋白由91个氨基酸组成，分子量约为14kD。该成熟蛋白编码氨基酸序列与囊丝黄精凝集素同源性为60.9％，多花黄精凝集素58.7％，雪花莲凝集素为44.0％，蜘蛛抱蛋凝集素结构域1为43.2％，蜘蛛抱蛋凝集素结构域2为52.6％，麦冬凝集素为75.9％。在blocks数据库(www.blocks.fhcrc.org)中检索POL 蛋白氨基酸序列的结构域，发现POL氨基酸序列中存在两个凝集素功能结构域区，并具有2个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)。成熟蛋白序列中，疏水氨基酸占39.6％，亲水氨基酸占42.9％，碱性氨基酸占9.9％，酸性氨基酸占7.7％。此基因的克隆，为深入研究POL结构基因，剪切机制，表达和调控机制以及POL结构和功能的关系奠定了重要的基础。

目录

声明

第一部分大黑花芸豆(Phaseolus multiflorus.Willd)凝集素的分离、纯化和性质研究

摘要

前言

1.材料和试剂

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器与设备

2.方法

2.1大黑花芸豆凝集素(PML)的分离纯化

2.2糖抑制实验

2.3温度对凝血活性的影响

2.4酸碱度对凝血活性的影响

2.5变性剂对PML凝血活性的影响

2.6色氨酸残基的修饰

2.7 PML荧光光谱分析

3.结果

3.1 PML的分离纯化

3.2 PML的性质测定结果

4.讨论

参考文献

第二部分玉竹凝集素(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce lectin,POL)的基因克隆及序列分析

摘要

引言

1.材料

1.1植物材料、菌株及常用质粒载体

1.2试剂盒、酶

1.3培养基

1.4药品

2.方法

2.1玉竹总RNA的提取

2.2反转录及聚合链式扩增法

3结果和分析

3.1玉竹总RNA的提取

3.2玉竹凝集素cDNA基因的克隆

3.3玉竹凝集素基因全长核甘酸序列及推导的蛋白序列的分析

3.4 POL成熟蛋白编码氨基酸序列的同源性分析

3.5 POL蛋白的性质与结构的预测

4讨论

参考文献

文献综述 豆科凝集素的研究进展

在读期间发表论文

致谢