香灰菌产凝集素培养条件的优化和香灰凝集素的分离纯化及部分性质的研究

摘要

真菌凝集素是一类来源于真菌,且不同于抗体和酶的蛋白质或糖蛋白,它能与糖特异和可逆地结合,并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用。近年来,对真菌凝集素的研究发展较快,主要集中在其生理生化特性和生物学功能方面,如在植物防病抗虫、抗肿瘤、抗病毒和基因工程等方面有着较为深入的研究和应用。
　　本论文通过研究不同培养条件对香灰菌(Hypoxylon sp.)菌丝体合成凝集素的影响,优化其培养条件,然后从培养得到的菌丝体中分离纯化出凝集素,并对它的理化性质和生物学活性进行了初步的研究,为进一步的开发利用奠定基础。采用单因素实验对碳源、氮源和碳氮比等发酵条件进行了初步的优化筛选,确定了较适的发酵培养条件:碳源为乳糖,氮源为酵母膏,碳氮比为2:1。在此优化发酵条件下进行摇瓶发酵培养,香灰菌丝体中合成凝集素的最高效价为1600 U/mL。香灰菌菌丝经磨粉、浸取、硫酸铵分级沉淀,得到香灰凝集素粗品。再经DEAE-Cellulose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析,可获得纯化的香灰凝集素(Hypoxylon sp.lectin,HSL),纯化倍数为9.8倍,蛋白质回收率为13％。经SDS-PAGE检测为单一蛋白染色带,其亚基分子量约为15.7kDa。电泳凝胶经Schiff试剂染色后有一条淡弱的蛋白带,表明香灰凝集素中含有糖基,是一种糖蛋白。蒽酮-硫酸法测的HSL含有15.5％的中性糖。通过β-消去反应测得香灰凝集素中糖和蛋白质的连接键为O-型糖肽键。对HSL进行紫外光谱的扫描发现,其最大吸收波长为280.4 nm。HSL能够凝集天然的兔红细胞、鼠红细胞和人A、B、O型红细胞,但是未表现出血型专一性和种属专一性,其对兔红细胞的最低凝集浓度为0.02μg/mL。通过糖抑制实验显示其凝集活性会被乳糖和D-半乳糖所抑制,且D-半乳糖的抑制浓度要低于乳糖。凝集素的活性在20-40℃之间保持基本不变,在50℃及以上温度时活性对温度的变化比较敏感,可见HSL是一种热较不稳定糖蛋白。HSL经100mmol/LHCl处理后,其凝血活性降低到原来的1/8,而在相应浓度的NaOH处理后,其活性不受任何影响,但经3 mmol/L的NaOH处理后,其活性下降为原来的1/2。用EDTA去除HSL分子中的金属离子后,HSL的凝血活性丧失,表明HSL是金属离子依赖型凝集素,通过加入Al3+、Fe3+均可使其凝血活性恢复甚至增加,而加入Mg2+、K+对HSL活性的恢复无任何作用。抑菌实验表明,HSL表现出对高粱炭疽病原菌具有抑制作用,而在浓度为0.1mg/mL时不影响棉花枯萎、山药枯萎、番茄叶霉、番茄枯萎、黑曲霉、棉花红腐等真菌的生长,同时HSL对金黄色葡萄菌、大肠杆菌、志贺氏菌等细菌也无任何抑制作用。

目录

摘要

ABSTRACT

缩略语表

1 引言

1.1 凝集素的概念和分类

1.1.1 凝集素的概念

1.1.2 凝集素的分类

1.2 凝集素的结构

1.2.1 凝集素的糖链结构

1.2.2 凝集素的亚基结构

1.2.3 凝集素的晶体结构

1.3 凝集素的分离方法

1.4 凝集素的生物学功能

1.4.1 植物凝集素的生物学功能

1.4.2 动物凝集素的生物学功能

1.4.3 真菌凝集素的生物学功能

1.5 凝集素的应用

1.5.1 研究细胞表面的特征、鉴定糖链结构

1.5.2 分离和纯化含糖高分子

1.5.3 用于分离细胞

1.5.4 利用凝集素设计抗菌、抗病毒药物

1.5.5 用于恶性肿瘤等疾病的诊断

1.5.6 作为抗肿瘤药物的研究

1.6 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 培养基

2.2.1 PDA培养基

2.2.2 种子培养基

2.2.3 牛肉膏蛋白胨培养基

2.3 主要试剂配置

2.3.1 Schiff试剂

2.3.2 Alsevers氏抗凝剂

2.3.3 磷酸缓冲液配置

2.3.4 考马斯亮蓝R-250染色液

2.3.5 考马斯亮蓝脱色液

2.3.6 考马斯亮蓝G-250

2.3.7 SDS-PAGE分离胶制备

2.3.8 SDS-浓缩胶的制备

2.4 实验试剂

2.5 实验设备

2.6 实验方法

2.6.1 鼠红细胞的分离

2.6.2 透析袋的处理方法

2.6.3 血凝集活性的测定方法

2.6.4 不同碳氮源对香灰菌丝合成凝集素的影响

2.6.5 HSL的分离纯化

2.6.6 凝集素纯度和亚基分子量的测定

2.6.7 电泳凝胶的糖染色法

2.6.8 蛋白质浓度的测定

2.6.9 凝集素中性糖含量测定

2.6.10 凝集素糖肽键特征分析

2.6.11 凝集素紫外扫描

2.6.12 HSL的生化特性

2.6.13 凝集素的抑菌实验

3 结果与分析

3.1 血凝集活性的测定

3.2 碳氮源优化的结果

3.2.1 碳源的选择结果

3.2.2 氮源的选择结果

3.2.3 碳氮比的选择结果

3.3 HSL的分离纯化

3.3.1 硫酸铵沉淀的最佳分级范围

3.3.2 DEAE-纤维素离子交换层析

3.3.3 Sephadex G-100凝胶过滤层析

3.4 HSL的纯度鉴定

3.5 HSL亚基分子量和糖蛋白染色

3.6 HSL中性糖含量

3.7 HSL糖肽键特征分析

3.8 紫外吸收光谱的测定

3.9 HSL的生化特性

3.9.1 HSL的糖抑制实验

3.9.2 HSL的热稳定测定

3.9.3 HSL的酸碱稳定性

3.9.4 金属离子对HSL的凝集活性的影响

3.10 HSL的抑菌实验

4 讨论

4.1 香灰菌的培养优化

4.2 HSL的分离纯化

4.3 HSL对血红细胞凝集的作用机理

4.4 HSL的抑菌作用

5 总结

5.1 碳氮源优化的结果

5.2 凝集素的分离纯化

5.3 凝集素的生物学性质

5.4 凝集素的抑菌作用

参考文献

致谢

附录