环境多重耐药细菌中分子遗传特征及耐药传播机制研究

摘要

目前，抗生素耐药性问题已引起全球的广泛关注。然而，抗生素耐药细菌，尤其是环境中不同种属的多重耐药细菌中耐药特征与耐药传播机制仍不清楚。因此，本研究以大量不同种属的鸡粪源多重耐药细菌和不同环境源的多重耐药大肠杆菌为研究对象，系统研究了其抗生素耐药表型和分子遗传特征。　　本研究主要内容包括：⑴研究了33株不同种属（13个属21个种）的鸡粪源多重耐药细菌中耐药遗传特征。采用8类11种抗生素对其进行药敏试验，对其质粒和基因组DNA同时进行8类61种抗生素耐药基因和18种可移动元件的检测，并对整合子和ISCR1所介导的耐药基因盒进行检测，主要结果如下:第一，33株菌均为多重耐药细菌，且93.94％的菌株具有5种以上的抗生素耐药性。第二，33株菌中共检测到8类47种耐药基因，每一株菌内检出27～36种耐药基因，且四环素和氨基糖苷类耐药基因检出率最高，而链阳菌素类和万古霉素类检出率最低。第三，33株菌中共检测到12种可移动元件，且intI1、IS26、ISAba1、ISEcp1和ISCR1的阳性检出率均超过90％。对intI1、intI2和ISCR1的可变区进行检测，共得到9种不同的基因盒(739～4754bp)。intI1介导的基因盒种类最多为丰富多样，有7种:dfrA12+orfF+aadA2、aadB+cat+blaOXA-10+aadA1+dfrA1+aac4、aac(6')-Ⅱ+blaOxA-21+catB3+aadA1+ybxI、dfrV、accA4+cmlA1、dfrA16+aadA2+cmlA1和aadA1;intI2和ISCR1均只携带一种基因盒，分别为:dfrA1+sat2+aadA1+ybeA和orf513+blaDHA-1+ampR。其中，dfrA12+orfF+aadA2的分布最为普遍(n=16)，在23个intI1介导的基因盒中占73.91％。第四，33株菌的耐药基因型与耐药表型高度一致，且大环内酯类一致性最高(96.97％)。⑵研究了不同环境来源的多重耐药大肠杆菌中耐药遗传特征。以畜禽粪便、城市污水处理厂剩余污泥和医院废水中分离的共计55株多重耐药大肠杆菌为研究对象，采用8类11种抗生素对其进行药敏试验，对其中35株菌的质粒和基因组DNA进行8类61种抗生素耐药基因、18种可移动元件及质粒的检测，并对整合子和ISCR1所介导的耐药基因盒进行检测，主要结果如下:第一，55株多重耐药大肠杆菌均具有10种以上抗生素耐药性。第二，35株多重耐药大肠杆菌中共检测到8类35种抗生素耐药基因，氨基糖苷类、磺胺类和喹诺酮类耐药基因最为普遍，而大环内酯类、万古霉素类和链阳菌素类耐药基因最少，且不同环境源的多重耐药大肠杆菌所携带的耐药基因种类相对一致。第三，不同环境来源的多重耐药大肠杆菌中所携带质粒的多样性存在明显的差异。其中，医院废水源耐药大肠杆菌中所含质粒高度一致(90％)，而畜禽粪便和城市污水处理厂剩余污泥中相对多样。第四，35株多重耐药大肠杆菌共检测到13种可移动元件，且ISEcp1、IS26、ISAba1、ISCR1、TnpA/Tn21和intI1在三种不同的环境中检出率均为100％。对intI1、intI2和ISCR1的可变区进行检测，共得到11种不同的基因盒，其中，intI1中检测到7种，intI2中仅检测到同一种基因盒，ISCR1可变区检测到3种基因盒。不同环境源的多重耐药大肠杆菌中，intI1所携带耐药基因盒的多样性具有明显的差异:医院废水源多重耐药大肠杆菌中仅检测到一种基因盒（dfrA17+aadA5），具有明显的单一性和高度的一致性;粪源多重耐药大肠杆菌中检测到6种耐药基因盒(dfrA17+aadA5、aadA2、aadA22、aadA23、aac(6')-Ib+aadA22和dfrA12+orfF+aadA2）;而城市污水处理厂活性污泥中检测到4种耐药基因盒(dfrA17+aadA5、aadA22、dfrA12+orfF+ aadA2和aac(6')-Ib-like+cmlA1-like），且其中有2株菌同时携带两种基因盒(aadA22/ dfrA17+aadA5和aadA22/dfr12+orfF+aadA2)。不同环境中耐药基因盒的多样性差异，在一定程度上暗示了其所处环境的差异性和复杂程度。⑶对彭氏变形杆菌(Proteus penneri) ss4中的质粒进行分离测序和鉴定。第一，彭氏变形杆菌ss4中存在五条明显的质粒条带，按照电泳迁移率由慢到快依次为pY1、pY2、pY3、pY4和pY5。第二，采用酶切克隆和高通量测序的方法，分别得到全长为2373bp的质粒pY5和3263bp的pY3。第三，序列分析表明，pY3和pY5均未携带任何耐药基因，但pY3携带三个转座酶基因，且pY3和pY5间有一段1369bp的序列高度相似(97.31％)，暗示了同一株菌内质粒间的相互关联。第四，经质粒电泳图谱、酶切图谱和序列比对，证实pY4和pY5为同一质粒的两种形式，即pY5为超螺旋质粒，而pY4为线型质粒。菌株ss4的质粒DNA中检测到了28种耐药基因，但质粒pY3、pY4(或pY5)上均未携带任何耐药基因，表明小质粒不是该菌携带耐药性的主要载体。该变形杆菌内可能存在一些15kb以上的大质粒，有待于进一步研究。

目录

摘要

缩略语表

第一章 引言

1．1 环境中细菌耐药性的产生

1．2 细菌耐药机制

1．2．1 药物主动外排机制

1．2．2 抗生素灭活(钝化)酶机制

1．2．3 抗生素作用靶位点保护或改变

1．2．4 代谢途径通路的改变

1．2．5 细菌外膜通透屏障的改变

1．3 抗生素耐药基因在环境中的传播与扩散

1．3．1 抗生素耐药基因的概念

1．3．2 抗生素耐药基因的传播元件

1．3．3 抗生素耐药基因在畜禽粪便-土壤系统中的传播与扩散

1．4 环境中抗生素耐药性的研究方法

1．4．1 基于培养方法的微生物的分离鉴定

1．4．2 基于PCR技术的耐药基因的检测

1．4．3 基因芯片技术

1．4．4 宏基因组学

1．5 研究内容

第二章 鸡粪源多重耐药细菌中耐药遗传特征研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 仪器与设备

2．2．2 主要试剂耗材

2．2．3 培养基与常用溶液的配制

2．2．4 药敏纸片

2．2．5 实验菌株

2．3 实验方法

2．3．1 药敏试验

2．3．2 抗生素耐药基因与可移动元件引物的选择

2．3．3 基因组DNA的提取

2．3．4 质粒DNA的提取

2．3．5 PCR扩增产物测序分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 33株鸡粪源多重耐药细菌的耐药表型

2．4．2 粪源多重耐药细菌中抗生素耐药基因的多样性与分布

2．4．3 粪源多重耐药细菌种属内及种属间耐药遗传特征差异分析

2．4．4 鸡粪源多重耐药细菌中可移动元件的多样性与分布

2．4．5 粪源多重耐药细菌中整合子(或ISCR1)-耐药基因盒的特征

2．5 本章小结

第三章 不同环境来源的多重耐药大肠杆菌中耐药遗传特征研究

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 仪器与设备

3．2．2 主要试剂耗材

3．2．3 培养基与常用溶液的配制

3．2．4 药敏纸片

3．2．5 实验菌株

3．3 实验方法

3．3．1 药敏试验

3．3．2 抗生素耐药基因与可移动元件引物的选择

3．3．3 质粒与基因组DNA模板的制备

3．3．4 PCR扩增产物测序分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 不同来源的多重耐药大肠杆菌中抗生素耐药表型特征

3．4．2 不同来源的多重耐药大肠杆菌中质粒的检测

3．4．3 不同来源的多重耐药大肠杆菌中抗生素耐药基因的多样性与分布

3．4．4 不同来源的多重耐药大肠杆菌中可移动元件的多样性

3．4．5 不同来源的多重耐药大肠杆菌中整合子-耐药基因盒的特征比较

3．5 本章小结

第四章 多重耐药Proteus penneri中质粒的分子特征研究

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 仪器与设备

4．2．2 主要试剂

4．2．3 培养基与常用溶液的配制

4．2．4 实验菌株

4．3 实验方法

4．3．1 感受态细胞的制备

4．3．2 质粒的提取及单个质粒条带的分离纯化

4．3．3 酶切

4．3．4 连接

4．3．5 转化及蓝白斑筛选

4．3．6 菌液PCR鉴定阳性克隆

4．3．7 酶切验证阳性克隆

4．3．8 阳性克隆药敏试验

4．3．9 质粒测序鉴定及分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 Proteus penneri中质粒的检测结果

4．4．2 Proteus penneri中单个质粒的分离纯化及酶切结果

4．4．3 阳性克隆重组子筛选结果及酶切验证

4．4．4 T362菌株药敏试验结果

4．4．5 pY5和pY4质粒的测序与组装

4．4．6 pY5质粒测序结果分析

4．4．7 pY3质粒测序结果分析

4．4．8 pY3与pY5序列关联分析

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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