医院废水和城市污水处理系统中多重耐药细菌的分子转移特征及相关性研究

摘要

医院废水和城市污水处理系统被普遍认为是多重耐药细菌和耐药基因的一个储存库，是向自然环境传播耐药细菌和耐药基因的重要媒介。近几十年来，伴随着水体环境中抗生素污染程度的不断加重，抗生素耐药细菌和耐药基因的多样性和丰度也在日益增加。目前，涉及医院废水和城市污水处理系统中多重耐药细菌和耐药基因的系统性研究还比较少，尤其是耐药基因与耐药因子的相关性研究还比较少。本研究选取两个季节（1月份:冬季与7月份:夏季）的三个医院废水和三个不同处理工艺城市污水处理系统进水、二沉池出水和脱水污泥作为研究对象，利用平板培养方法和现代分子生物学技术分别对多重耐药细菌和耐药基因的丰度和多样性进行研究。
　　本研究主要内容包括：⑴四环素、土霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星在医院废水和污水处理系统中含量较高，医院废水中抗生素浓度高于城市污水。Al、Fe和Mg是污水处理系统中浓度较高的三种重金属。⑵由污水处理系统中抗生素和重金属的残留浓度可知，从进水样品到二沉池出水样品，四环素、氧氟沙星、土霉素、诺氟沙星、Cu、Al、Cr、Fe、Pb和Ti的浓度有明显的消减。重金属Mn、 Cd和As在二沉池出水样品中的残留显著高于国家标准，Mn、Cr和As是其标准的3.58、10.5和88.47倍。脱水污泥中As显著高于CJ/T309-2009《城镇污水处理厂污泥处置农用泥质》B级标准，是其标准的5.89倍。⑶医院废水中、城市污水处理系统中进水、二沉池出水和脱水污泥中总可培养细菌的丰度分别为1.75×109～3.31×1010 cfu/L、1.09×109～5.75×1010 cfu/L、1.13×107～3.90×107 cfu/L和1.30×108～2.97×109 cfu/g（干重，下同）;医院废水、城市污水处理系统中进水、二沉池出水和脱水污泥中三重耐药细菌的百分比分别为4.89％～8.11％、0.19％～2.25％、0.72％～4.82％和0.58％～5.26％;五重耐药细菌的百分比分别为2.14％～5.05％、0.02％～0.47％、0.18％～1.03％和0.25％～0.96％;八重耐药细菌的百分比分别为0.12％～0.42％、0.0036％～0.2698％、0.0345％～0.5680％和0.0851％～0.6140％。医院废水总可培养细菌和多重耐药细菌丰度与污水处理系统进水样品在一个数量级。医院废水中的多重耐药细菌的百分比高于污水处理系统所有样品。⑷污水处理过程中总可培养细菌和多重耐药细菌从进水到二沉池出水消减了1～4个数量级，且丰度消减处于极显著水平。7月份样品中多重耐药细菌的百分比显著或极显著高于1月份样品。二沉池出水中多重耐药细菌的比例显著（或极显著）高于进水中。⑸在属的水平上，医院废水中总细菌主要集中在弓形杆菌属，不动杆菌属，拟杆菌属，Paludibacter，Macellibacteroides，气单胞菌属，硫磺单胞菌属，Faecalibacterium，假单胞菌属和Prevotella9中。医院废水中多重耐药细菌主要集中在埃希氏杆菌属、不动杆菌属、香味菌属、肠球菌属、寡养单胞菌属、产碱杆菌属和短波单胞菌属中。污水处理系统中多重耐药细菌主要集中在埃希氏杆菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、假单胞菌属、短波单胞菌属、香味菌属、变形杆菌属、摩根氏菌属、节杆菌属和弓形杆菌属中。这些菌属大多属于G-细菌，并且很多物种属于致病菌或条件致病菌。⑹根据高通量qPCR检测结果，医院废水和污水处理系统样品中耐药基因检出数量为131～160种，耐药基因检出频率高达73.60％～89.89％。其中，β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类耐药基因检出频率和检出数量较大。⑺通过qPCR分析污水处理系统中耐药基因的绝对丰度可知，医院废水、污水处理厂进水、二沉池出水和脱水污泥中的16S rRNA的拷贝数达到0.88×108～2.26×108 copies/ml、1.22×108～3.02×108 copies/ml、1.56×107～5.01×107copies/ml和1.08×1010～4.36×1010 copies/g（干重）;可移动元件的的拷贝数分别为0.76×108～4.8×108 copies/ml、3.08×106～6.22×107 copies/ml、1.78×106～2.01×107copies/ml和1.46×106～1.40×109 copies/g;四环素类耐药基因的的拷贝数为5.20×106～8.80×107 copies/ml、1.15×106～6.44×106 copies/ml、1.87×104～～3.78×105copies/ml和5.76×103～8.72×103 copies/g;大环内酯类耐药基因的的拷贝数分别为1.18×106～3.30×106 copies/ml、1.27×106～1.17×107 copies/ml、3.63×104～3.73×105copies/ml和1.97×105～1.73×108 copies/g;磺胺类耐药基因的的拷贝数分别为1.43×107～7.76×107 copies/ml、9.28×106～1.22×107 copies/ml、4.31×105～1.61×106copies/ml和6.13×108～2.02×109 copies/g;喹诺酮类耐药基因的的拷贝数分别为3.14×104～6.90×104 copies/ml、6.45×104～1.35×105 copies/ml、4.29×103～8.02×104copies/ml和2.16×104～3.65×105 copies/g。⑻与进水相比，二沉池出水中可移动元件、四环素类、大环内酯类、磺胺类和喹诺酮类耐药基因的拷贝数分别降低了0～1.27 logs、0.48～2.54 logs、0.53～2.51 logs、0.76～1.45 logs和0～1.27 logs。可移动元件在整个污水处理过程中的相对丰度最高达到0.75，这相当于至少3/4的细菌含有可移动元件基因。⑼可移动元件、四环素类和磺胺类耐药基因在医院废水中的相对丰度为0.86～2.12、0.05～0.39和0.13～0.23，且高于污水处理系统中的相对丰度。通过比较，可移动元件和耐药基因的相对丰度（平均值）高低次序为:可移动元件＞磺胺类＞四环素类＞大环内酯类＞喹诺酮类。⑽根据相关性分析结果，城市污水处理系统中多重耐药细菌丰度与多种耐药基因丰度之间存在显著的正相关性。可移动元件、耐药基因与甲氧苄氨嘧啶、四环素、氧氟沙星、土霉素、诺氟沙星、磺胺甲恶唑、头孢氨苄、环丙沙星、恩诺沙星、螺旋霉素和红霉素之间存在显著或极显著的相关性。多种可移动元件、耐药基因与重金属之间也存在显著地正相关性。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 水体环境中抗生素的污染

1．1．1 抗生素的定义与种类

1．1．2 抗生素的代谢周期

1．1．3 抗生素在水体环境中的残留及去除方法研究

1．2 水体环境中耐药细菌的研究

1．2．1 细菌耐药性产生的机理

1．2．2 水体环境中耐药细菌和耐药基因的研究现状

1．3 医院废水中耐药细菌和耐药基因的研究现状

1．4 城市污水处理系统中耐药细菌和耐药基因的研究现状

1．4．1 几种常见的城市污水处理工艺的概述

1．4．2 城市污水处理系统中耐药细菌的研究现状

1．4．3 城市污水处理系统中耐药基因的研究现状

1．5 环境中耐药基因的分析检测方法

1．5．1 基于抗生素平板培养法的细菌分离鉴定

1．5．2 基于PCR技术耐药基因的检测

1．5．3 基因芯片技术

1．5．4 宏基因组学

1．6 本研究的目的和意义

第二章 医院废水中多重耐药细菌和耐药基因研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 主要试剂和培养基

2．2．3 主要仪器

2．2．4 污水样品抗生素的萃取

2．2．5 UPLC-MS／MS检测分析

2．2．7 样品预处理

2．2．8 医院废水中总可培养细菌和多重耐药细菌数量的统计

2．2．9 多重耐药细菌的收集

2．2．10 多重耐药细菌总DNA的提取

2．2．11 样品总DNA的提取

2．2．12 多重耐药细菌高通量测序

2．2．13 多重耐药细菌的16S测序

2．2．14 药敏试验

2．2．15 医院废水中耐药基因的qPCR检测

2．2．16 qPCR引物标准曲线的绘制

2．3 结果与讨论

2．3．1 抗生素在医院废水中的残留

2．3．2 医院废水中总可培养细菌和多重耐药细菌的丰度

2．3．3 医院废水中多重耐药细菌的多样性

2．3．4 医院废水中可移动元件和耐药基因的多样性

2．3．5 医院废水中可移动元件和耐药基因的丰度

2．4 小结

第三章 城市污水处理系统中抗生素和重金属的残留

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 样品采集

3．2．2 样品预处理

3．2．3 主要仪器与试剂

3．2．4 样品处理

3．2．8 ICP-MS质量控制

3．3 结果与讨论

3．3．1 抗生素在城市污水处理系统中的残留

3．3．2 重金属的污染特征

3．4 小结

第四章 城市污水处理系统中多重耐药细菌丰度和多样性研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 样品采集

4．2．2 样品预处理

4．2．3 主要试剂和培养基

4．2．4 主要仪器

4．2．5 城市污水处理系统中总可培养细菌和多重耐药细菌数量的统计

4．2．6 多重耐药细菌的收集

4．2．7 多重耐药细菌总DNA的提取

4．2．8 多重耐药细菌高通量测序

4．2．9 多重耐药细菌的16S测序

4．2．10 药敏试验

4．3 结果与讨论

4．3．1 脱水污泥的含水率

4．3．2 城市污水处理系统中总可培养细菌和多重耐药细菌的丰度

4．3．3 城市污水处理系统中多重耐药细菌的多样性

4．4 小结

第五章 城市污水处理系统中可移动元件和耐药基因及环境污染因子相关性研究

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 样品采集

5．2．2 主要试剂与仪器

5．2．3 样品总DNA的提取

5．2．4 污水处理系统中耐药基因的qPCR检测

5．2．5 数据处理

5．3．1 城市污水处理系统中可移动元件和耐药基因的多样性

5．3．2 城市污水处理系统中可移动元件和耐药基因的丰度

5．3．3 污水处理系统中可移动元件和耐药细菌丰度与多重耐药基因丰度之间的相关性

5．3．4 污水处理系统中耐药基因丰度与可移动元件丰度之间的相关性

5．3．5 污水处理系统中可移动元件和耐药基因的丰度与抗生素浓度之间的相关性

5．3．6 污水处理系统中可移动元件和耐药基因丰度与重金属残留之间的相关性

5．4 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

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