分支氨基酸促进纳他霉素生物合成的代谢调控研究

摘要

纳他霉素是一种生物防腐剂，其研究与使用逐渐引起人们的关注，并已成为当今食品保藏研究的热点。纳他霉素主要由纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌经发酵产生，是一种高效、广谱的多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素，能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长，具有低剂量、高效率、无嗅无味、适用pH范围广、专一性好和安全性高等特点，已被大多数国家批准为食品防腐剂在食品工业应用。　　添加分支氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）已被证明是提高微生物次级代谢产物的一种有效方式，该物质既可以作为碳源使用，也可以充当氮源利用，其代谢产物如乙酰CoA，丙酰CoA等是多烯大环内酯类物质生物合成的前体。目前，在纳他霉素发酵中关于添加分支氨基酸调控生物合成的研究较少，具体的调控机制更是有待深入的探究。本论文主要研究内容为：　　1.以StreptomycesnatalensisHW-2为研究对象，考察了添加L-缬氨酸。L-亮氨酸和L-异亮氨酸对纳他霉素生物合成的影响，并优化出L-缬氨酸对纳他霉素生物合成的影响最大。在纳他霉素发酵至36h时添加0.5g/LL-缬氨酸，纳他霉素产量达到1.82g/L，比对照组提高了80%。添加L-缬氨酸后引起菌体生物量降低和pH升高，而葡萄糖利用速率加快；胞内丙酮酸激酶（PK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PC）活性增强，柠檬酸合酶（CS）活力降低了33.6%；发酵液中丙酮酸、草酰乙酸和乙酰辅酶A的含量分别提高了80.5%、44.4%和47.4%，乙酸、丙酸和α-酮戊二酸的含量分别提高了17%、10.3%和15.6%，而柠檬酸的含量降低了22.5%。　　2.基于RNA-Seq技术对培养基中添加和未添加L-缬氨酸的S.natalensisHW-2的对数期前期、对数期后期和稳定期的前期进行转录组全测序。结果显示，发酵48h，有201个基因上调，445个基因下调；发酵到60h，147个基因上调，42个基因下调；发酵到84h，45个基因上调，72个基因下调。GO分析显示差异表达的基因主要参与生物调控、代谢过程、细胞过程、膜组分、催化活性、运输等过程，主要表现在羧酸的生物合成和分解代谢、氨基酸的生物合成和代谢等出现了大量的富集。KEGG分析显示添加缬氨酸后在氨基酸的生物合成，脂肪酸代谢，碳代谢，C5支链二元酸代谢，丁酸盐和丙酸盐代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及降解，戊糖磷酸途径等途径出现了富集。分别从糖酵解途径，戊糖磷酸途径，三羧酸循环等途径，对基因的转录水平进行分析。添加缬氨酸后，基因转录水平的变化，改变了碳的而流通量，为纳他霉素的生物合成提供了更多的前体物质。对编码纳他霉素生物合成的I型聚酮合酶基因簇的转录水平进行分析，发现基因簇转录水平差异表达不显著。对样品进行RT-PCR验证，实验结果与转录组数据基本一致，说明转录组数据是可靠的。　　3.S.natalensisHW-2中ilvH基因功能的验证，根据缬氨酸的合成途径和转录组数据，选择基因乙酰乳酸合酶的调节亚基（ilvH）为目的基因进行过表达，验证基因功能。乙酰乳酸合酶的活性受ilvH的调节，通过基因工程的方法，ilvH过表达的S.natalensisHW-2会提高纳他霉素的产量。从S.natalensisHW-2基因组中找到到了ilvH基因序列，设计引物克隆得到目的基因，以质粒pIB139为基础构建ilvH的过表达质粒。将重组质粒转化到ET12567(pUZ8002)中，通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移将目的基因整合到S.natalensisHW-2中，通过抗性筛选过表达突变株，并发酵检测纳他霉素的产量，ilvH过表达菌株较原始菌株纳他霉素产量提高37.93%。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 纳他霉素概述

1.1.1 纳他霉素的发现

1.1.2 纳他霉素的理化性质

1.1.3 纳他霉素的抑菌机理

1.1.4 纳他霉素的特点

1.1.5 纳他霉素的应用

1.2 纳他霉素的研究进展

1.2.1 纳他霉素的生物合成途径

1.2.2 提高纳他霉素产量的方法

1.3 分支氨基酸对微生物代谢合成的影响

1.3.1 分支氨基酸

1.3.2 分支氨基酸在抗生素发酵中的应用

1.3.3 分支氨基酸的作用机理

1.4 本研究的目的意义与内容

1.4.1 本研究的目的与意义

1.4.2 本研究的内容

第2章 分支氨基酸对纳他霉素生物合成的影响

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.2.1 菌株

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验设备与仪器

2.2.4 培养基

2.3 实验方法

2.3.1 氨基酸的添加方法

2.3.2 纳他霉素发酵

2.3.3 酶活力测定

2.3.4 乙酰辅酶A摩尔浓度测定

2.3.5 短链羧酸质量浓度测定

2.3.6 纳他霉素产量测定

2.3.7 细胞生物量，葡萄糖质量浓度和pH测定

2.3.8 数据处理

2.4 结果与分析

2.4.1 支链氨基酸对纳他霉素产量的影响

2.4.2 缬氨酸添加时间的优化

2.4.3 缬氨酸对S.natalensis HW-2发酵过程的影响

2.4.4 缬氨酸对糖酵解的影响

2.4.5 缬氨酸对三羧酸循环的影响

2.4.6 缬氨酸对胞外短链脂肪酸前体的影响

2.4.7 缬氨酸对乙酰辅酶A生成的影响

2.5 小结

第3章 L-缬氨酸对S.natalensis HW-2转录水平的影响

3.1 前言

3.2 实验材料与仪器

3.2.1 菌株

3.2.2 实验试剂

3.2.3 实验仪器

3.2.4 培养基

3.3 实验方法

3.3.1 样品制备

3.3.2 总RNA提取

3.3.3 转录组测序及文库构建

3.3.4 基因表达量统计

3.3.5 差异表达分析

3.3.6 qRT-PCR分析验证

3.4 结果与分析

3.4.1 取样时间确定

3.4.2 原始数据质量评估

3.4.3 差异基因表达分析统计

3.4.4 GO富集分析

3.4.5 KEGG富集分析

3.4.6 qRT-PCR验证

3.5 小结

第4章 S.natalensis HW-2中ilvH基因功能的验证

4.1 前言

4.2 实验材料及仪器

4.2.1 菌株及质粒

4.2.2 引物

4.2.3 实验试剂及试剂盒

4.2.4 培养基及试剂配制

4.2.5 仪器设备

4.3 实验方法

4.3.1 纳塔尔链霉菌基因组DNA的提取

4.3.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

4.3.3 大肠杆菌感受态的制备与转化

4.3.4 大肠杆菌质粒DNA的小量抽提

4.3.5 目的DNA的琼脂糖凝胶回收纯化

4.3.6 目的基因的获取

4.3.7 双酶切获得目的片段

4.3.8 载体与目的片段的连接

4.3.9 大肠杆菌和链霉菌之间的接合转移

4.3.10 阳性菌落的筛选与验证

4.3.11 ilvH过表达后的S.natalensis HW-2发酵检测

4.4 实验结果与分析

4.4.1 纳塔尔链霉菌基因组DNA的提取

4.4.2 目的基因的获取

4.4.3 载体的构建

4.4.4 大肠杆菌和链霉菌的结合转移实验

4.4.5 阳性菌落的传代筛选与验证

4.4.6 ilvH过表达后的S.natalensis HW-ilvH发酵检测

4.5 小结

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

附录Ⅰ 目的基因序列

致谢

攻读学位期间的研究成果