冷冻载体优化制备及对牛卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

摘要

哺乳动物的卵子冷冻技术在珍稀动物品种资源保存、人类辅助生殖领域及胚胎研究中一直是重要的研究内容。卵母细胞玻璃化冷冻过程中，冷冻体积、冷冻保护剂浓度、冷冻降温-解冻速率等因素是影响冷冻效果的关键，合适的冷冻载体可以减小冷冻体积，从而提高降温-解冻的速率。近年来，虽有多种载体的报道研究，但不同研究者报道的制作方法和效果不尽相同。因此本研究旨在探索不同载体的研究方法，以卵母细胞冷冻后的发育能力为评定指标，通过4种冷冻载体的对比试验，筛选出在我们现有实验条件下的最佳玻璃化冷冻载体并探讨冷冻不同发育时期卵母细胞的冷冻效果，从而为提高卵母细胞的冷冻保存效果奠定技术基础。　　1.冷冻载体制备方法研究　　试验1：OPS载体的优化。将细管一分为二，分别以常规酒精灯和简易酒精灯为热源，对细管一端旋转加热，待前端待细管前端膨大时，迅速用小镊子将膨大部分向另一端平稳拉伸，经冷却固定后，剪去前端膨大部获得 OPS冷冻载体。结果表明，只有以简易小酒精灯为热源可对 OPS载体成功优化，且此方法不仅能增加细管的受热均匀度，易于操作，而且也能减少材料损耗。　　试验2：GMP载体制备方法研究。以卵针前端细部（内径约为1 mm，管壁厚度约为0.09 mm，长度约为6 cm）为原材料，分别以 PC-10型拉针仪、常规酒精灯和简易酒精灯为热源，探究 GMP载体的制备方法；以玻璃管（外径0.8 cm）为原材料，以酒精喷灯为热源，探究GMP载体的制备方法。结果显示：以酒精喷灯为热源，以细玻璃管为原材料可以成功制备出GMP载体。　　试验3：GMP冷冻载体的改进。以酒精喷灯和常规酒精灯为热源，分别对外径为0.8 cm、0.4 cm和0.3 cm玻璃管旋转加热。结果显示，外径为0.8 cm的玻璃管制备的GMP载体与外径为0.5 cm的制备效果并无差异；外径为0.4 cm和0.3 cm的细玻璃管以酒精喷灯为热源，制备出的载体外径在0.43~0.5 mm间，保留其后端的载杆经测量发现距前端载体约4 cm可以作为 GMP载体使用，但该方法材料损耗较大；以常规酒精灯为热源时，制备的载体经测量外径为0.4~0.5 mm，管壁厚度约为0.03 mm，距后端载体约3 cm可作为GMP载体，并且在制备的过程中载体和载杆间会有一小玻璃气泡产生，冷冻时对虹吸作用也有一定促进作用。　　结论：用常规酒精灯，外径为0.3 cm和0.4 cm玻璃管制备的GMP载体效果最佳，将塑料细管一分为二，使其一端加热可在原有 OPS制备方法基础上极大降低了损耗。　　2.不同载体对牛未成熟卵母细胞玻璃冷冻效果的比较　　将抽取的COCs随机分为5组，OPS组、GMP组、冷冻叶片组、自制叶片组以及对照组。4组冷冻组细胞经液氮冷冻解冻后分别进行 IVM、IVF和IVC，新鲜对照组不做冷冻处理，直接进行 IVM、IVF和 IVC，统计成熟率、卵裂率和囊胚率。结果显示：冷冻组的形态正常率、成熟率、卵裂率以及囊胚率与新鲜对照组各项指标（100％、78.1%±3.1%、64.4%±2.8%、34.7%±2.5%）均显著差异（P＜0.05），OPS组和 GMP组形态正常率（74.3%±1.8%，72.5%±2.6%）无显著差异（P﹥0.05），上述二组均显著低于冷冻叶片组（82.1%±1.3%，P＜0.05），但三组间成熟率、卵裂率和囊胚率均无显著差异（P﹥0.05），自制叶片组则与其他冷冻组的各项发育指标差异均显著（P＜0.05）。　　结论：自制 OPS、GMP冷冻载体均可成功地玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞。　　3.不同发育时期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响　　将抽取的COCs随机分为4组，体外培养0 h、8 h、16 h、以及22 h，采用GMP冷冻法分别冷冻培养不同时间的卵母细胞，解冻后继续依此培养24 h、16 h、8 h、和2 h，之后分别进行IVM、IVF、IVC，统计各组的形态正常率、成熟率、卵裂率以及囊胚率。结果显示：经解冻后培养0h、8h、16h和22h的形态正常率分别为72.7%、75.3%、77.7%和78.0%，四组间差异均不显著（ P﹥0.05），培养0 h的卵母细胞同培养8h的各项发育指标差异均不显著（ P﹥0.05），但培养16 h的卵母细胞与前两者各项发育指标差异均显著（P＜0.05），而培养22 h的卵母细胞各项发育指标均高于其他发育时期组。　　结论：卵母细胞的抗冻性随其成熟程度增加而增强。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 哺乳动物卵子冷冻保存的进展

1.2 冷冻原理

1.3 冷冻保护剂

1.4 卵子冷冻保存方法

1.5 冷冻载体与冷冻过程中降温-复温速率

1.6 冷冻对卵子的损伤

1.7 影响卵子冷冻保存的因素

1.8 冷冻未成熟卵母细胞的意义

1.9 冷冻卵子或胚胎在生产实践中的应用及展望

第2章 冷冻载体制备方法研究

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

2.5 结论

第3章 不同载体玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞的效果比较

3.1 试验材料与试剂

3.2 试验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

第4章 不同发育时期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 试验结果

4.4 讨论

4.5 结论

参考文献

缩略语词汇表

附录

致谢

攻读学位期间的研究成果