基于调控Nrf2通路的金水缓纤方治疗肺纤维化抗氧化机制

摘要

目的：⑴基于系统药理学阐明金水缓纤方的有效成分，预测靶点和潜在的作用机制。⑵采用博来霉素制备的大鼠肺纤维化模型，观察金水缓纤方的疗效和抗氧化的作用。⑶利用TGF-β1诱导MRC-5细胞模型，采用血清药理学方法、RNA干扰等技术，观察核转录相关因子2（Nuclear factor E2 related factor2, Nrf2）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase4, NOX4）在金水缓纤方调控MRC-5细胞活化的作用，探讨金水缓纤方调控Nrf2、NOX4治疗肺纤维化的作用机制，为其防治提供新的策略。　　方法：①建立金水缓纤方的化学成分数据库，计算口服生物利用度（Oral bioavail-ability, OB）和类药性（Drug-likeness index, DLI），以OB≥30%和DLI≥0.18为筛选条件，筛选金水缓纤方的活性成分群。建立基于化学基因组学、化学信息学和药理学的靶标预测模型，利用该模型预测金水缓纤方活性成分的对应靶点，并建立靶点库。将金水缓纤方活性成分及其对应的靶点投入到Cytoscape中构建成分-靶点网络，并分析各化学成分与靶点的拓扑学参数。从而推测关键化学成分与靶点。将金水缓纤方对应靶点及其相关疾病投入到Cytoscape软件中构建靶点-疾病网络，并分析各靶点与疾病的拓扑学参数。②将SD大鼠随机分为正常组、模型组、金水缓纤组及吡啡尼酮组。采用一次性气管内注入博来霉素的方法制备肺纤维大鼠模型，应用免疫组化、肺功能检测、实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）、蛋白质印迹（Western blot，WB)等技术，观察第7、14、28、42天大鼠肺组织病理、肺功能、羟脯氨酸含量、抗氧化指标及NOX4/Nrf2 mRNA和蛋白的变化。③以MRC-5细胞为研究对象，采用TGF-β1诱导建立细胞模型。采用血清药理学、RNA干扰、激光共聚焦、qPCR和WB等技术，测定纤维化相关因子、氧化/抗氧化指标变化，考察Nrf2蛋白在金水缓纤方抗纤维化中的作用。　　结果：⑴金水缓纤方拥有136种活性成分，可作用于265个潜在的靶点，并且不同的活性成分可以调控相同的靶点。其对多种疾病都具有潜在治疗作用；另外，该方可能通过多种途径如抗氧化、抗炎等发挥治疗作用。⑵金水缓纤方能够改善肺纤维化大鼠的肺损伤、肺功能，降低胶原沉积，其综合疗效在治疗后第14、28天明显。金水缓纤方能够改善博来霉素诱导肺纤维大鼠的氧化应激状态，主要表现在上调超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase, T-SOD）、谷胱甘肽（ Glutathione, GSH）、过氧化氢酶（ Catalase, CAT），下调髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的水平。研究也显示金水缓纤方能下调NOX4的表达，上调Nrf2的表达，在治疗后的第28天疗效较为明显。⑶金水缓纤方含药血清能够抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞的活化，主要表现在能够下调MRC-5细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）、纤维连接蛋白1（Fibronectin1, FN1）mRNA和蛋白表达。金水缓纤方可上调TGF-β1诱导MRC-5细胞内Nrf2及其下游还原型辅酶/醌氧化还原酶1（NAD(P)H:Quinone oxidoreductase1, NQO1）、血红素氧合酶1（Heme oxygenase1, HO1）的表达，下调氧化酶NOX4的表达和ROS水平。应用Nrf2siRNA阻断后，金水缓纤方含药血清对TGF-β1诱导MRC-5细胞α-SMA、FN1 mRNA和蛋白的表达无显著抑制作用。　　结论：①采用系统药理学成功预测金水缓纤方的活性成分、对应靶点及相关疾病。金水缓纤方靶蛋白的生物学功能具有多样性，主要包括氧化还原酶活性、MAPK相关蛋白以及G蛋白耦联受体活性、白细胞分化及迁移、Toll样受体10信号通路，这可能是其治疗疾病的药理机制。②水缓纤方治疗肺纤维化具有较好疗效，能够改善肺组织损伤、肺功能，减轻纤维化程度。此外，该方可显著抑制纤维化大鼠的氧化应激，上调抗氧化相关蛋白Nrf2和下调氧化相关蛋白NOX4。③金水缓纤方能够抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，降低其氧化应激水平。沉默Nrf2可显著抑制该方作用。表明Nrf2在金水缓纤方抑制TGF-β1诱导MRC-5细胞的活化中发挥关键作用。

目录

声明

缩略词

前言

参考文献

第一部分 金水缓纤方的系统药理学研究

1 前言

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二部分 金水缓纤方对博来霉素诱导肺纤维化大鼠疗效及抗氧化作用

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三部分 金水缓纤方调控Nrf2抗氧化机制

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

结语

结论

创新点

缺点及不足

致谢

附录一 中医药治疗肺纤维化疗效及安全性的系统评价

附录二 氧化应激与肺纤维化