丹蒌片促进兔腹主动脉粥样硬化药物涂层支架置入后再内皮化的调控机制研究

摘要

目的：观察丹蒌片对兔腹主动脉粥样硬化药物涂层支架置入后再内皮化的影响，探索其可能机制。　　方法：⑴兔腹主动脉粥样硬化药物涂层支架置入模型的制备及实验分组：选用雄性新西兰兔（清洁级），高脂饲料饲养1周后行腹主动脉球囊损伤术，继续高脂饲料饲养7周，行腹主动脉造影，于最狭窄处置入药物洗脱支架，随机分为4组，即空白对照组（等渗生理盐水）、瑞舒伐他汀组（瑞舒伐他汀1mg/kg·d）、丹蒌片组（丹蒌片0.5g/kg·d），丹蒌片+瑞舒伐他汀组（丹蒌片0.5g/kg·d+瑞舒伐他汀1mg/kg·d），每组各7只。各组在模型制备完成后均经灌胃途径给予相应药物，连续干预12周。⑵血脂、肝肾功能监测：全自动生化分析仪检测PCI术前及PCI术后12周各组血脂及肝肾功能水平（TC、TG、ALT、AST、Cr）。⑶检测各组血清CRP、MCP-1、VEGF、MMP-9、SDF-1的水平:ELISA法检测药物干预12周后各组血清CRP、MCP-1、VEGF、MMP-9、SDF-1水平。⑷HE染色观察支架术后12周的血管的病理变化。⑸检测各组CD34、vWF的表达水平：通过免疫组化染色检测各组支架段血管CD34、vWF的表达情况。⑹OCT评价支架置入后血管愈合的情况：通过OCT评价药物干预12周后各组支架小梁覆盖率、管腔面积、新生内膜厚度、新生内膜面积等指标。⑺评价再内皮化情况：通过扫描电镜评价各组支架内腔面的内皮细胞爬行、新生内膜覆盖及血小板粘附聚集情况。⑻检测细胞通路相关蛋白表达水平：采用Western-Blot法检测药物干预12周后各组临近支架段腹主动脉组织中p-PI3K、p-Akt、eNOS的表达水平。　　结果：①动物模型：球囊损伤及高脂喂养满8周后，腹主动脉造影显示血管严重狭窄（30~90%）。病理染色证实：正常兔腹主动脉HE染色提示腹主动脉内膜光滑完整，未见脂质及胆固醇结晶沉积；腹主动脉球囊损伤及高脂饲养8周后，腹主动脉HE染色提示动脉内膜可见多量胆固醇结晶沉积，内膜增厚，管腔呈“偏心性”狭窄；同时心肝肾组织亦可见脂质沉积等组织形态结构改变。在动脉粥样硬化狭窄的基础上置入药物涂层支架，血管造影显示支架血流通畅，无支架贴壁不良等并发症。②血脂、肝肾功能：结果显示：PCI术前各组TG、TC、LDL-c水平无明显差异（均P>0.05）；PCI术后12周丹蒌片组、瑞舒伐他汀组和丹蒌片+瑞舒伐他汀组较干预前血清血脂水平明显降低（P<0.05），且瑞舒伐他汀的作用强于丹蒌片组（P<0.05），而丹蒌片+瑞舒伐他汀组的作用又高于瑞舒伐他汀组（P<0.05）；PCI术前后血清肝肾功能监测提示未见明显差异（均P>0.05）。③血清炎症因子：ELISA法检测提示：用药后空白对照组血清CRP及MCP-1水平较其他三组明显增高，且丹蒌片+瑞舒伐他汀组低于丹蒌片组及瑞舒伐他汀组，差异有统计学意义（P<0.05）；用药后丹篓片组、瑞舒伐他汀组、丹蒌片+瑞舒伐他汀组血清VEGF，MMP9，SDF-1，eNOS水平较空白对照组明显升高，且瑞舒伐他汀组高于丹蒌片组，而丹蒌片+瑞舒伐他汀组的作用又高于瑞舒伐他汀组（均P<0.05）。④OCT扫描：腹主动脉OCT扫描：各组支架均由完整内膜覆盖，支架小梁覆盖率无明显差异（P>0.05）；空白对照组新生内膜厚度（NIH Thickness），新生内膜面积（NIH Area）明显高于其他3组（P<0.05）；空白对照组管腔面积（Luman Area）明显低于其他3组，瑞舒伐他汀治疗后减少新生内膜厚度和面积的作用高于丹蒌片组，而丹蒌片+瑞舒伐他汀组又高于瑞舒伐他汀组（均P<0.05）。⑤HE病理染色：HE染色后结果显示：各组均可见支架表面由完整内皮细胞覆盖；空白对照组可见内膜过度增殖，伴支架内动脉粥样硬化形成，而其他3组内膜光滑完整，未见管腔狭窄。⑥含支架段血管免疫组化染色：免疫组化染色提示，空白对照组中支架内膜表面的内皮细胞标志物CD34和vWF表达均不充分，而丹蒌片组和瑞舒伐他汀组内膜表面CD34和vWF表达增加，丹蒌片+瑞舒伐他汀组的内皮细胞标志物均匀的在内膜表面表达。⑦扫描电镜：TESCAN扫描电镜：所有标本均完成了支架处的内膜覆盖；空白对照组内皮细胞的数量明显减少，尽管高倍镜下可见瑞舒伐他汀组细胞的数量较丹蒌片组较多，但细胞排列紊乱，而且丹蒌片组内皮细胞的形态更接近正常。丹蒌片+瑞舒伐他汀组的内皮细胞排列紧密，内皮细胞形态更完整。⑧信号通路蛋白相关蛋白表达：Western-Blot法检测p-PI3K、p-Akt、eNOS水平提示药物干预明显升高丹蒌片组、瑞舒伐他汀组、丹蒌片+瑞舒伐他汀组p-PI3K、p-Akt、eNOS表达水平（P<0.05），且瑞舒伐他汀组高于丹蒌片组，而丹蒌片+瑞舒伐他汀组又高于瑞舒伐他汀组（均P<0.05）。　　结论：⑴丹蒌片具有降脂，抑制炎症反应的作用，可促进兔腹主动脉粥样硬化支架置入模型实现完整再内皮化，且与瑞舒伐他汀联合应用后作用增强。⑵丹蒌片促进支架内完整再内皮化的作用可能通过调控PI3K/AKT信号通路而实现，可能与上调p-PI3K及p-AKT信号蛋白的表达有关。

目录

声明

缩略语表

前言

材料与方法

1 实验动物

2 实验试剂

3 实验仪器

4 试验方法及步骤

5 数据测量

6 统计学处理

结果

1 动物模型

2 兔的一般情况及血脂、肝肾功能监测

3 血清炎症因子水平

4 OCT扫描

5 含支架段血管硬组织病理染色

6 含支架段血管免疫组化染色

7 扫描电镜

8 PI3K、Akt、eNOS信号通路蛋白表达

讨论

1 兔动脉粥样硬化及药物涂层支架置入模型

2 丹蒌片对兔血清CRP、MCP-1、VEGF、MMP9、SDF-1、eNOS的影响

3 OCT成像与支架内再狭窄

4 病理及免疫组化染色与电镜扫描评价支架置入后再内皮化

5 丹蒌片干预支架段组织p-PI3K/p-AKT蛋白表达

结论

致谢

参考文献

附录1：病理照片

附录2：文献综述:冠心病支架置入术后再内皮化的研究进展

附录3：在校期间科研情况和论文著作