2型糖尿病大鼠模型主动脉MMP-1、TIMP-1的表达变化和血管壁胶原代谢改变及吡格列酮的干预效应

摘要

目的：2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)大血管并发症患病率是非糖尿病人群的3～5倍，是2型糖尿病患者的主要并发症和致死的主要原因。而大血管病变的主要病理改变是动脉粥样硬化。糖尿病与动脉粥样硬化关系密切，表现为糖尿病患者出现动脉粥样硬化的时间早、程度重和预后差，控制血糖可以明显减少慢性微血管并发症，但不能显著降低动脉粥样硬化所致的大血管并发症。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一大类能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和基底膜成分的锌依赖性肽链内切酶家族，与结缔组织的降解和重建有关。金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)为其特异性抑制剂。二者在体内通过特定的途径调节，若调节发生紊乱，将导致各种疾病的发生。最近研究发现MMPs、TIMPs及二者的平衡失调与T2DM合并动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生、发展有关。过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ(Peroxisome Proliferator-activatedreceptor-γ，PPARγ)是细胞核内受体大家族成员，在脂质和脂蛋白新陈代谢、葡萄糖代谢中发挥关键作用。噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZDs)类药物是PPARγ的激动剂，可有效改善IR，降低血糖，纠正脂代谢紊乱，已日益广泛应用于2型糖尿病的治疗中。最近研究表明：PPARγ参与了动脉血管炎症反应和AS的形成和发展，PPAR γ的活化可直接作用于血管壁，对血管壁具有保护作用。PPAR γ激动剂对血管炎症的抑制作用可能对慢性炎症疾病，尤其是糖尿病大血管并发症的治疗具有重要意义。罗格列酮和吡格列酮是目前最常用的TZDs类药物，除降低高血糖、改善脂质代谢紊乱，还有降低血压、减少蛋白尿及抗动脉粥样硬化等作用。胶原酶-1(MMP-1)主要裂解间质I型、III型胶原，引起胶原变性，使其变得对明胶酶的水解作用敏感，在ECM的降解过程中具有重要作用，作用于AS发生、发展过程中的所有关键环节。关于MMP-1与斑块的稳定性的研究较多，在动脉粥样硬化斑块中表达水平较高，过度表达使斑块破裂的危险增加。目前对MMP-1在糖尿病大血管病变早期病变中的作用的研究较少。本试验研究目的在于观察链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的高脂高糖喂养的糖尿病大鼠模型中大动脉壁MMP-1、TIMP-1的表达变化，并应用吡格列酮进行干预，观察其对MMP-1、TIMP-1表达及血管内皮功能的影响，探讨吡格列酮在糖尿病大血管病变中的作用机制，并为预防和延缓糖尿病大血管病变提供有力理论依据和有效治疗方法。 方法：健康雄性SD大鼠45只，8周龄，体重216±15g，由河北省实验动物中心提供。随机分为正常对照组(NC组)15只和实验组30只，NC组喂以标准大鼠饲料，实验组喂以高糖高脂高热量饲料，4周后实验组给予一次性腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg，NC组大鼠给予同等剂量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，各组以原饲料继续喂养2周后，内眦静脉取血测空腹血糖≥7.8mmol/L者为糖尿病大鼠。再将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM组)和吡格列酮干预组(PIO组)。PIO组每日给予吡格列酮11mg/(Kg·d)灌胃治疗，NC组及DM组每日给予同PIO组等体积的生理盐水灌胃。实验末NC组剩余大鼠15只，DM组12只，PIO组13只。每组大鼠于实验开始、注射STZ前及注射STZ两周后和实验结束称重、取血。大鼠自采血前一日20:00起禁食，实验日8:00分别从内眦静脉采血3ml，分离血清，-20℃保存，用于各指标的检测。于第14周末(即造模成功后8周)处死动物，留取胸主动脉4％中性多聚甲醛固定，待组织学检查。 1.血糖、胰岛素测定血糖采用葡萄糖氧化酶法测定。空腹胰岛素(FINS)采用放射免疫法测定。应用稳态模式评估法胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及空腹胰岛素敏感性指数(ISI)评价胰岛素抵抗的程度。 2.血脂的测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)采用比色法测定(以mmol/L计)。FFAs用Cu+比色法测定。 3血管内皮功能生化指标的测定血浆内皮素(ET)采用放射免疫分析法测定，单位：pg/ml。血清NO测定采用硝酸还原酶法，单位：μmol/L。 4动脉组织形态学检查常规方法制备大鼠动脉光镜组织切片，行苏木素-伊红(HE)染色，Masson染色，免疫组织化学染色。 5统计学处理 所有数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以均数士标准差表示，组间差异用两样本均数的t检验进行比较，两组以上比较采用单因素方差分析。显著性用P值表示，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有极显著性。 结果： 1实验开始时大鼠随机分组，各组体重无统计学差别。高糖高脂喂养1月时即注射STZ前大鼠实验组体重明显高于NC组，差异有极显著性(P＜0.01)。造模成功后大鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，体重明显下降，活动减弱，一般状态差。实验末PIO组和DM组体重明显高于NC组，有极显著性差异(P＜0.01)，PIO组较DM组体重下降，有显著性差异(P＜0.05)。 2.STZ造模前各组大鼠空腹血糖无差别。腹腔注射STZ后2周时，实验组血糖明显高于对照组，有极显著性差异(P＜0.01)。实验末PIO组血糖低于DM组(P＜0.05)，但两组血糖仍高于NC组，有极显著性差异(P＜0.01)。造模前实验组胰岛素水平明显高于NC组，有极显著性差异(P＜0.01)。实验末DM组与PIO组胰岛素水平仍高于对照组，有显著性差异(P＜0.05)，PIO组胰岛素水平低于DM组，有显著性差异(P＜0.05)。造模前实验组大鼠的TC、TG、FFA均明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.01)。实验末PIO组的TC、TG、FFA明显低于DM组(P＜0.05)，但仍高于NC组(P＜0.05)。造模前实验组大鼠的ET均明显高于NC组，有显著性差异(P＜0.01)。实验末PIO组的ET低于DM组(P＜0.05)，但仍高于NC组(P＜0.05)。造模前实验组大鼠的NO均明显低于NC组，有显著性差异(P＜0.01)。实验末PIO组的NO高于DM组(P＜0.05)，但仍低于NC组(P＜0.05)。 3.组织学观察显示：实验末光镜下NC组大鼠动脉壁未见明显病理变化，糖尿病大鼠动脉壁出现局限性内膜增厚，但未见大量泡沫细胞等典型AS病理改变。主动脉横断面上可见较多的内膜增厚病灶，病灶处内皮细胞连续性断裂或缺失，内弹力板厚薄不均，有断裂分离现象，中膜浅层SMC轻度增生、排列紊乱。Masson染色：NC组动脉壁胶原含量较少，内膜和中膜仅见少量绿染区域；DM组和PIO组内膜增厚，内膜绿染区明显增加，红色的平滑肌细胞周围可见绿染；计算机图文分析染为绿色总面积占统计场总面积的百分比对胶原含量进行半定量，并做统计学分析显示：实验组与NC组比较均具有统计学意义(P＜0.05)，PIO组较DM组胶原含量减少，有显著性差异(P＜0.05)。 4免疫组化检测显示实验末NC组主动脉MMP-1、TIMP-1表达较少，仅内皮细胞胞浆少量表达。DM组MMP-1、TIMP-1表达明显增多，阳性细胞呈棕黄色，定位于细胞浆，内皮细胞和内膜下区域可见阳性表达，与NC组相比有统计学意义(P＜0.05)。而PIO组表达水平低于DM组，高于NC组有显著性差异(P＜0.05)。 结论： 1.高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射成功制备2型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠模型8周时即出现动脉粥样硬化早期病理改变。 2.2型糖尿病大鼠主动脉早期大血管病变中MMP-1与TIMP-1的表达和活性失调，导致血管壁胶原代谢紊乱，促进了动脉粥样硬化的发生发展。 3.吡格列酮通过激活PPARγ具有改善糖脂代谢、增加胰岛素敏感性、减少胰岛素抵抗的作用，还可通过调节MMP-1与TIMP-1的表达及改善血管内皮功能等，对糖尿病状态下的大血管起到了保护作用，减缓了糖尿病大血管病变的发展进程。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述：基质金属蛋白酶、细胞外基质与糖尿病大血管病变

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