去甲斑蝥素对四氯化碳诱导急性肝损伤大鼠的保护作用及活化肝星状细胞凋亡的影响

摘要

肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理变化结果,其长期存在是导致肝纤维化,甚至肝硬化、肝癌发生的重要始动因素。四氯化碳诱导肝损伤模型是经典的肝损伤模型,其机制是氧化应激在肝损伤中起着主导作用,造成肝细胞变性、坏死及炎症反应。在肝损伤和损伤修复过程中,静止型肝星状细胞激活转变为肌成纤维细胞(MYB),具有产生大量ECM的特征,并且当损伤刺激不能及时去除,多数向肝纤维化发展。因此,去除病因、减轻肝损伤、针对过量活化}tSC靶向治疗等成为综合防治肝损伤的主要措施。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)作为斑蝥素的衍生物不仅保留了抗肿瘤活性和提升白细胞的作用,并且明显降低了毒副作用。已有报道NCTD可以保护肝功能,但是保肝机制均未详细报道。并且还具有抗乙肝病毒作用。研究显示NCTD能够诱导肿瘤细胞凋亡,推测NCTD对活化HSC具有诱导凋亡作用。为此,本研究来研究去甲斑蝥素对四氯化碳肝损伤的保护保护作用及抗氧化应激机制,同时探讨其对大鼠活化HSC是否具有促凋亡作用,从而为去甲斑蝥素临床应用提供实验依据。　　 目的:本课题旨在研究观察NCTD对四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤保护作用及活化肝星状细胞凋亡的影响。　　 方法:　　 ①实验大鼠被随机分为正常对照组、肝损伤模型组(模型组)、双环醇对照组(阳性对照组)和去甲斑蝥素两个剂量的治疗组(10mg/kg,20mg/kg)。模型组、阳性对照组和治疗组分别用四氯化碳造成大鼠急性实验性肝损伤,去甲斑蝥素组加用去甲斑蝥素片分两个剂量(10mg/kg/d,20mg/kg/d)于造模型当天即开始灌胃2周。阳性对照组用双环醇120mg/kg/d灌胃,正常对照组和肝损伤模型组灌胃以相同剂量的蒸馏水2周。各组均于2周末留取标本。经组织石蜡切片}玎巳及Masson染色检测模型建立及治疗后的病理改变情况;利用病理图像分析软件来检测肝组织Masson染色胶原面积密度:测定血清ALT、AST酶含量;测定肝组织SOD活性含量和MDA含量;免疫组化方法检测肝组织中α-SMA的表达变化;TUNEL和α-SMA免疫组织化学双标染色方法检测HSC的凋亡。　　 ②NCTD干预体外培养的大鼠肝星状细胞,研究其对肝星状细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、Casepase3活性的变化及对活化的肝星状细胞凋亡的影响。　　 结果:　　 ①四氯化碳诱导的急性肝损伤模型组与正常组比较,模型组血清ALT、AST。酶含量升高,且模型组大鼠肝脏明显肿胀,外观呈暗黄或土黄色。通过肝组织石蜡切片脏和Masson三色染色病理显示肝脂肪变性明显,炎细胞浸润和纤维组织增生等。结果证明四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型建立成功。双环醇组和NCTD组治疗后上述病理改变均减轻。　　 ②NCTD对大鼠肝功能的影响:模型组血清ALT和AST’含量比正常对照组升高了559.78％和212.29％均有显著差别(P＜0.01);双环醇组和NCTD治疗组(20 mg/kg)与模型组比较,均使ALT降低了35.19％和27.19％,AST降低了42.45％和39.18％,统计均有意义(P＜0.05);双环醇组和NCTD(20mg/kg)治疗组没有明显差异(P＞0.05)。　　 ③通过对胶原面积密度半定量分析,结果显示模型组比正常对照组胶原含量明显升高了317.3％(P＜0.01);双环醇组和NCTD治疗组均使得胶原含量降低,统计结果有意义(P＜0.05),但治疗的三组间没有统计差异(P＞0.05)。　　 ④NCTD对大鼠肝组织氧化应激的影响:与正常组相比,模型组肝组织中SOD含量降低了75.5％和MDA含量升高405.64％,统计有明显差别(P＜0.01);治疗后,双环醇对照组和治疗组与模型组比较肝组织中SOD含量升高和MDA含量降低均有差别(P＜0.05);双环醇和NCTD(20 mg/kg)治疗效果相同,但二者没有统计差异(P＞0.05)。　　 ⑤用免疫组织化学检测α-SMA在损伤大鼠肝脏的表达变化,结果模型组肝组织α-SMA的阳性表达细胞明显高于正常对照组648.8％有显著差别(P＜0.01),NCTD(10mg/kg、20mg/kg)治疗组较模型组下降17.6％和39.25％,差别有统计意义(P＜0.05),呈剂量依赖关系。　　 ⑥TUNEL和α-SMA免疫组织化学双标染色方法检测HSC的凋亡表明,治疗组在凋亡数和凋亡率均高于模型组(P＜0.05),特别是高剂量(20 mg/kg)NCTD组表现明显。　　 ⑦JC-1试剂盒流式细胞仪法检测细胞的早期凋亡线粒体膜电位改变结果示:5.0μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于HSCs6h、12h、24h与阴性对照组相比线粒体膜电位均降低(0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016)较阴性对照组(1.872±0.019)相比,均有统计学差异(P＜0.05)。　　 ⑧Caspase3活性检测显示:5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星状细胞6h、12h、24h、36h后,Caspase3活性(0.657±0.033、0.785±0.037、1.771±0.177、4.806±0.15)较对照组(0.325±0.015)相比明显升高,加入Ac-EDVE-CHO后(2.763±0.152)较去甲斑蝥素36h组有所下降,Caspase3活性总体差异显著,有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论:NCTD能够减轻四氯化碳诱导的肝损伤程度具有保肝作用,其机制可能是通过抗脂质过氧化实现的。NCTD能够诱导活化的HSC凋亡。

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 去甲斑蝥素研究进展及其在肝病中的应用前景

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