实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织中Prx2和NF-κB的表达情况及依达拉奉的干预作用

摘要

目的:多发性硬化(multipie sclerosis,MS)是一种中枢神经系统的炎症性脱髓鞘疾病,好发于年轻女性,临床上大多表现为缓解-复发的病程,且复发往往较初发临床表现重,药物敏感性下降,严重者致残,影响患者的生活质量。迄今为止对MS的确切病因及发病机制仍不完全清楚,也无肯定有效的防治药物。目前多数学者认为MS的发病涉及遗传、病毒、免疫、环境地理等,是多因一果。　　 尽管多发性硬化的发病涉及多方面因素,但有一点却得到专家共识的,即氧化应激参与多发性硬化的发生发展密切相关。研究氧化应激,选择自由基清除剂,中断后续的级联放大反应,可能成为多发性硬化治疗的靶点。　　 peroxiredoxins(Prxs)是近十余年新发现的一种抗氧化蛋白,分子量为25-30KD,属于抗氧化蛋白超家族。Prx2是这个家族的典型代表,尤其是在中枢神经系统,具有神经元保护作用,受到越来越多的关注。　　 核因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)是1986年由Sen和Baltimore首次从B淋巴细胞核中检测到的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子,普遍存在于真核细胞中。在神经系统内担当免疫重任的胶质细胞内存在非活性的NF-κB,氧化应激是中枢神经系统内NF-κB的活化信号,活化后的NF-κB进入核内,与Prx2基因调节区κB序列结合,加强基因的表达,保护机体免受氧化应激损伤。　　 依达拉奉(Edaravone)注射液是国内近几年开发上市的一种新型的小分子自由基清除剂,易透过血脑屏障,多用于脑血管病。近年来有学者发现依达拉奉可以抑制活化的小神经胶质细胞的活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)的产生及iNOS mRNA的表达,并减轻小神经胶质细胞诱导的神经元死亡和树突毒性现象。活化的小神经胶质细胞被认为与炎症性脱髓鞘疾病的发病机理有关,这意味着依达拉奉对MS可能具有治疗价值。　　 本实验就是通过建立多发性硬化的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,,给予干预药物--地塞米松,依达拉奉,观察实验动物的发病率,行为学改变,脑组织病理学变化以及免疫组化观察Prx2和NF-κB,探讨Prx2和NF-κB在EAE发病机制中的作用以及依达拉奉的应用价值,为临床实践提供理论依据。　　 方法:　　 1动物分组:Wistar大鼠(6-8周龄,健康雌性,180-200g)90只,随机分为正常对照组、EAE模型组、地塞米松(dexamethasone,DXM)组、依达拉奉小剂量组(3mg·kg-1·d-1)、依达拉奉大剂量组(10mg·kg-1·d-1),共五组,每组18只。每组又随机分为7天、16天、23天三个亚组,每个亚组6只大鼠。　　 2模型制备:将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆,加上完全福氏佐剂(completeFreund's adjuvant,CFA)(卡介苗的剂量为6mg/ml),乳化后按0.5ml/只分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射。药物干预组于模型制备第一天起给予相应剂量的药物腹腔注射,每天一次,直至动物处死。　　 3神经功能评分:于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用Kono等提出的评分标准:1分:动物尾部无力;2分:尾部无力+肢体无力;3分:肢体轻度麻痹;4分:肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分:濒死状态。　　 4组织病理学及免疫组化观察:在动物麻醉状态下,快速取其大脑侧脑室周围组织,4％多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片,HE染色,光学显微镜下观察炎症细胞的浸润情况;免疫组化采用SP法,观察比较不同组阳性细胞数的变化。　　 结果:　　 1动物发病率观察:依达拉奉大剂量组和DXM组大鼠的发病率均低于EAE组,差异有统计学意义(p＜0.05)。依达拉奉小剂量组与EAE组大鼠之间的发病率差异没有统计学意义(p＞0.05)。　　 2行为学观察:各组大鼠在发病高峰期时(16天)神经功能评分比较,依达拉奉大剂量组、DXM组各大鼠神经功能评分明显低于EAE组(p＜0.05)。依达拉奉小剂量组与EAE组之间神经功能评分差异没有统计学意义(p＞0.05)。　　 3组织病理学观察:在疾病初期(7天),EAE组大鼠脑组织内即出现炎性细胞浸润,且症状越严重,炎性细胞越多。在发病高峰期(16天),依达拉奉大剂量组、DXM组大鼠脑组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目明显低于EAE组及依达拉奉小剂量组;疾病缓解期(23天),各组大鼠组织内的血管袖套数目均减少。　　 4脑组织中Prx2和NF-κB的表达Prx2表达:在疾病初期,高峰期和恢复期,EAE组大鼠脑组织Prx2和NF-κB的阳性细胞数先升高,后下降,与疾病的临床表现相关。应用地塞米松和大剂量依达拉奉后,发病高峰期Prx2和NF-κB阳性细胞数下降,小剂量依达拉奉组Prx2和NF-κB阳性细胞数无明显下降。与空白对照组相比,EAE组NF-κB的变化早于Prx2。　　 结论:　　 1 EAE大鼠脑组织中Prx2和NF-κB的表达与疾病的活动性有关。依达拉奉和地塞米松均可不同程度的抑制氧化应激,减少自由基的生成或清除自由基,因此,该组大鼠脑组织中Prx2和NF-κB的含量下降。　　 2大剂量依达拉奉可以明显降低EAE大鼠的发病率,减轻发病时神经功能损伤的程度和脑组织中炎性细胞的浸润。　　 3依达拉奉与地塞米松比较,虽然地塞米松在发病率和神经功能评分上优于依达拉奉,但是依达拉奉可以避免长期应用地塞米松引起的严重不良反应,充分显示出应用安全和耐受性良好的优势。

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文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

参考文献

综述 Peroxiredoxin在中枢神经系统的研究

致谢

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