实验性2型糖尿病大鼠脂肪肝发病机制及罗格列酮干预的研究

摘要

目的：非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质储积为特征的临床病理过程。其包括单纯性脂肪肝，脂肪性肝炎(NASH)，脂肪性肝纤维化和肝硬化。流行病学调查显示，NAFLD的人群患病率为20％，其中25％和10％的患者可分别进展为“隐源性”肝纤维化，甚至肝硬化。NAFLD的确切发病机制尚未完全阐明，其中以固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)及过氧化物酶体增值物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)为调控中心的糖、脂代谢紊乱，胰岛素抵抗等在NAFLD的发生发展过程中可能起着重要作用。罗格列酮(rosiglitizone，RSG)属于噻唑烷二酮类药物，是近年来应用广泛的胰岛素增敏剂，该药除了具有改善胰岛素抵抗，降低血糖水平外，许多研究还发现此药尚有改善脂质代谢紊乱，减轻肝脏脂肪蓄积和肝脏炎性变程度等作用。因此，本研究通过喂养高糖高脂饮食使大鼠出现胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)，再通过腹腔注射小剂量的链脲佐菌素(streptozoin，STZ)建立具有胰岛素抵抗的2型糖尿病大鼠模型，并分别给予胰岛素抵抗大鼠和糖尿病大鼠罗格列酮进行药物干预，观察各组大鼠肝脏脂质含量变化，肝组织脂肪变程度，并应用电镜观察IR及糖尿病大鼠肝脏细胞超微结构改变，探讨SREBP-1c和PGC-1α以及胰岛素抵抗与糖尿病大鼠脂肪肝的关系，试阐明脂肪肝的发病机制以及罗格列酮在改善脂肪肝中的作用机制。 方法：首先S-D大鼠随机分为两组，对照组(NC组)和胰岛素抵抗组(IR组)。正常对照组喂养标准大鼠饲料，胰岛素抵抗组饲以高糖高脂饲料。8周后，从NC组及IR组各随机抽取五只采血测定血糖和胰岛素并应用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术(Euglycemic insulin clamp)评价动物模型胰岛素敏感性。出现胰岛素抵抗，将IR组随机分为两组即胰岛素抵抗组和糖尿病组。并对后者以腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，25 ng/kg)损伤部分胰腺，使之出现高血糖。第11周把胰岛素抵抗组随机分为胰岛素抵抗对照组(IR组)和胰岛素抵抗应用罗格列酮治疗组(TIR组)，糖尿病组大鼠随机分为糖尿病对照组(DM组)和糖尿病应用罗格列酮治疗组(TDM组)。从实验第11周起，TIR组和TDM组大鼠以罗格列酮2mg/kg/溶于蒸馏水灌胃，每日一次；NC组，IR组，DM组分别给予等量蒸馏水灌胃，共8周。实验全程共持续18周。第18周末实验结束前测量大鼠体重，心脏采血氧化酶法测量空腹血糖(FBG)，放射免疫分析法测定血清胰岛素(FINS)，全自动生化分析仪测定血脂四项，包括：血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。以及丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬酸氨基转移酶(AST)。打开腹腔充分暴露肝脏，首先观察肝脏颜色及大小，取约1mm<'3>的肝组织以备制成电镜切片观察肝脏超微结构，另外取约1 cm<'3>的肝组织制成常规石蜡切片进行}玎巳染色，其余肝组织用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测SREBP-1c及PGC-1α基因表达水平。 结果：1、高糖高脂第8周IR组血糖较NC组有所增高，但无显著性差异(P>0.05)。TG，TC，FINS较NC组升高(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。葡萄糖输注率(glucose infusionrate，GIR)IR组明显低于NC组(P<0.01)。DM组经小剂量STZ腹腔注射后2周(即实验第10周)，血糖明显高于NC组(P<0.01)，FIN较IR组降低但仍高于NC组(P<0.05)。TC，TG明显高于NC组(P<0.01)。 2、18周末实验结束时，FBG在IR组与NC组无明显差异，DM组较NC组仍有显著升高。IR组和DM组大鼠的FINS，TC，TG，LDL，ALT仍较NC组高(P<0.01)，DM组体重降低(P<0.01)。TIR组和TDM组大鼠的FINS，TC，TG，LDL，ALT较各自对照组均显著下降。 3、肝脏病理形态的改变：正常对照组肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，其内偶见小脂滴；DM组肝细胞内可见大小不等的脂滴，肝细胞呈重度脂肪变性及肝细胞浊肿，可见少许淋巴细胞浸润；IR组肝细胞呈中一重度脂肪变性及中度肝细胞浊肿，未见明显淋巴细胞浸润；TDM组肝细胞内少量细小脂滴，呈轻度脂肪变性及淋巴细胞浸润；TIR.组肝细胞未见肝细胞脂肪变性，只有中央静脉周围肝细胞浊肿，偶可见少许淋巴细胞浸润。 4、电镜观察NC组大鼠肝细胞形态正常，排列整齐，细胞核规整，线粒体丰富，粗面内质网未见异常。DM组肝细胞体积明显增大，细胞内充满了大小不等的脂滴，线粒体肿大，大部分嵴消失，膜大部分融合，粗面内质网中度扩张，有明显脱颗粒现象。IR组肝细胞内亦充满脂滴，较细小，线粒体肿大，部分嵴消失，膜部分融合，粗面内质网轻度扩张，有轻度脱颗粒现象。TIR，TDM组肝细胞内有细小脂滴，线粒体轻度肿大，部分嵴消失，粗面内质网有轻度脱颗粒现象。 5、SREBP-1c在IR和DM组表达明显增加(P<0.01)，应用罗格列酮治疗后有明显下降(P<0.01)：PGC-1α在IR和DM组表达降低，应用罗格列酮治疗后有明显上升(P<0.01)。 6、相关性分析SREBP-1c与TG、FINS、LDL、ALT呈正相关，相关系数及P值分别为(0.935，0.000；0.662，0.010；0.783，0.001；0.961，0.000)；PGC-1α与TG，LDL呈负相关，相关系数及P值分别为(-0.811，0.000；-0.618，0.019)。 结论：1、通过8周的高糖高脂饮食，胰岛素抵抗组大鼠出现肥胖，脂代谢紊乱和高胰岛素血症，并应用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术证明IR模型复制成功。在此基础上给予小剂量STZ注射后，损伤部分胰岛β细胞，诱发出胰岛素相对分泌障碍，胰岛素抵抗持续存在。至此建立了2型糖尿病脂肪肝大鼠模型，该模型具有高血糖，血脂异常，胰岛素抵抗等特点，与人类2型糖尿病合并脂肪肝的临床特征类似，故此模型可用于2型糖尿病合并脂肪肝的研究。 2、实验结束时利用光镜和电镜观察到肝脏细胞出现明显的病理改变。 3、糖尿病脂肪肝大鼠存在着严重的糖、脂代谢紊乱，肝脏SREBP-1c基因表达明显升高，PGC-1α基因表达下降，这些因素既与胰岛素抵抗的发生密切相关，也表明在高糖高脂饮食诱导的大鼠肝脏脂肪变性即NAFLD发生中起着重要作用。 4、经罗格列酮干预后，胰岛素抵抗组和糖尿病组大鼠胰岛素敏感性增加，各种糖、脂代谢紊乱程度明显减轻，血清ALT水平降低，结合HE染色及电镜结果提示罗格列酮可显著改善脂肪肝大鼠的胰岛素敏感性及肝脏的脂肪变性。早期应用罗格列酮可以有效预防糖尿病肝脂肪变性的发生发展。

目录

论文说明：英文缩写

第一部分2型糖尿病大鼠模型的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分SREBP-1c和PGC-1α在糖尿病大鼠脂肪肝病变中的作用及罗格列酮的干预研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述SREBP-1c参与脂质代谢的调控及意义

致谢

个人简历