肝癌微球体细胞特异性结合七肽的筛选

摘要

目的：筛选能够与高转移性HCCLM3肝癌微球体特异性结合的环七肽，为后续的生物医学应用提供靶向分子。　　方法：利用超低吸附培养瓶和无血清培养基对HCCLM3进行培养，诱导其形成肝癌微球体。以肝癌微球体为靶细胞，HCCLM3和 LO2为吸附细胞，应用噬菌体环七肽库进行全细胞差减筛选。四轮筛选后，随机挑选噬菌体单克隆进行测序；根据测序结果，采用cell-ELISA对不同类型噬菌体克隆与肝癌微球体结合的亲和力和特异性进行检测。根据特异性最高的噬菌体克隆的融合蛋白基序来合成对应的环七肽。使用竞争抑制试验检验合成多肽对噬菌体克隆与靶细胞结合的抑制作用。运用激光共聚焦显微镜进一步验证合成多肽与肝癌微球体结合的特异性。细胞毒性试验检测多肽的生物学活性。　　结果：通过悬浮培养，LM3细胞成功聚集成球形成微球体，四轮差减筛选后，噬菌体克隆在肝癌微球体的富集率从（8.50×10-5±1.70×10-5）%提高到（1.0×10-2±4.08×10-4）%(P<0.001)。cell-ELISA结果显示P26号噬菌体克隆与肝癌微球体结合的特异性最高，其展示多肽的氨基酸序列为 NTGSPYE(命名为NTG肽)。竞争抑制试验结果表明：NTG肽对P26噬菌体与肝癌微球体的结合有抑制作用（P<0.01或P<0.001）。运用激光共聚焦显微镜观察标记FITC的NTG肽与细胞结合的结果显示：NTG肽能与肝癌微球体特异性结合，而与无关细胞则不发生结合。细胞增殖试验显示：NTG肽对细胞生长没有增殖活性。　　结论：用干细胞培养体系对肝癌细胞系进行悬浮培养能稳定获得肝癌微球体。筛选到的P26号噬菌体与肝癌微球体的结合具有最高特异性，其展示的环七肽序列为NTGSPYE。合成的NTG肽具有与肝癌微球体靶向结合的能力，且对细胞的生长无影响。因此，NTG肽作为介导与肝癌干细胞特异性结合的靶向载体，在今后肝癌早期诊断和靶向治疗的应用上具有进一步开发的潜质。

目录

声明

英文缩略词表

0引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 无血清悬浮培养使HCCLM3形成微球体

2.2 噬菌体随机肽库差减筛选在肝癌微球体上富集率明显升高。

2.3 第4轮洗脱液的噬菌体克隆测序

2.4 Cell-ELISA鉴定阳性噬菌体克隆

2.5 多肽的合成

2.6 竞争抑制试验初步证明合成多肽与靶细胞结合的独立性

2.7 细胞免疫荧光试验检测多肽的亲和力和特异性

2.8 检测NTG肽对细胞生长的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

综述：噬菌体展示技术在靶向于癌症诊治中的应用

作者简历

致谢

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