CBS基因干扰和OGD/R后SH-SY5Y细胞自噬和凋亡情况及相关信号通路研究

摘要

目的：　　利用siRNA干扰技术干扰胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)基因并构建细胞氧糖剥夺再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，探讨OGD/R和CBS基因干扰后SH-SY5Y细胞自噬和凋亡情况及相关信号通路变化。　　方法：　　构建OGD/R模型，体外模拟缺血再灌注过程，根据氧糖剥夺和再灌注时间不同共设9组，分别为正常对照组，氧糖剥夺4h/再灌注12h组（4h/12h组），氧糖剥夺4h/再灌注24h组（4h/24h组），氧糖剥夺8h/再灌注12h组（8h/12h组），氧糖剥夺8h/再灌注24h组（8h/24h组），氧糖剥夺12h/再灌注12h组（12h/12h组），氧糖剥夺12h/再灌注24h组（12h/24h组），氧糖剥夺24h/再灌注12h组（24h/12h组），氧糖剥夺24h/再灌注24h组（24h/24h组）。利用透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)观察各组细胞OGD/R后细胞内自噬小体形成情况；脂质体转染法将靶向CBS基因的siRNA转入SH-SY5Y细胞内，同时构建OGD/R模型，氧糖剥夺4h/再灌注24h。将细胞分为3个组，分别为CBS干扰组，OGD/R组和CBS干扰+OGD/R组。CBS干扰组以阴性对照（与干扰组siRNA有相同的碱基组成但与靶mRNA无同源性的一段核苷酸序列）作为对照，OGD/R组以正常细胞作为对照，CBS干扰+OGD/R组以阴性对照+OGD/R组作为对照组。为观察转染试剂对正常细胞的毒性作用，特增加正常对照组作为参照。以上各组各设3个复孔并进行3次独立重复实验；蛋白印迹法鉴定 CBS基因干扰效率，并检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和信号通路中 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达水平，以及凋亡信号通路中NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平；流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。　　结果：　　1.透射电镜观察细胞内自噬小体：除正常对照组和氧糖剥夺4h/再灌注12h组未观察到自噬小体外，其余各组均在胞质内观察到了较多自噬小体；2. CBS基因干扰效率：蛋白印记法检测CBS蛋白表达，结果显示，干扰组与阴性对照组比较 CBS蛋白表达量明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05），阴性对照组与正常对照组比较 CBS蛋白表达水平并无明显变化（P>0.05）。3.自噬相关蛋白及相关信号通路蛋白表达：3.1 CBS干扰组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR蛋白表达水平与阴性对照组比较均无统计学差异（P>0.05）。3.2 OGD/R组与正常对照组比较，OGD/R组 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），Beclin-1蛋白表达无显著差异（P>0.05），p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。3.3 CBS干扰+OGD/R组与阴性对照+OGD/R组比较，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR均无显著差异（P>0.05）。4.细胞凋亡检测结果：4.1 CBS干扰组细胞凋亡率与阴性对照组比较无统计学差异（P>0.05）。4.2 OGD/R组与正常对照组比较，OGD/R组细胞凋亡率明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。4.3 CBS干扰+OGD/R组与阴性对照+OGD/R组比较，细胞凋亡率无显著差异（P>0.05）。　　结论：　　OGD/R能够明显诱导 SH-SY5Y细胞发生自噬和凋亡，且可能与 Akt/mTOR及NF-κBp65/COX-2信号通路相关；CBS基因干扰对细胞自噬和凋亡均无明显影响。

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英文缩略词表

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.1 透射电镜观察OGD/R后细胞内自噬小体

2.2 siRNA干扰后CBS蛋白表达结果

2.3 CBS基因干扰和OGD/R后细胞自噬相关蛋白表达结果

2.4 CBS基因干扰和OGD/R后细胞凋亡检测结果

2.5 信号通路蛋白检测结果

3 讨 论

3.1 OGD/R后细胞自噬和凋亡

3.2 CBS/H2S体系与细胞自噬和凋亡

3.3 Akt/mTOR、NF-κBp65、COX-2与自噬和凋亡

4 结 论

参考文献

综述：自噬与缺血再灌注损伤

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