基于MAPK与NOS信号Crosstalk调控的EOFAZ对ox-LDL诱导HAECs损伤保护作用实验研究

摘要

目的：研究艳山姜挥发油（EOFAZ）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导损伤的人主动脉内皮细胞（HAECs）的保护作用及迁移和修复的影响，探索其保护作用是否与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与一氧化氮合酶（NOS）信号相关联，同时探索MAPK与NOS信号之间是否存在crosstalk调控，阐明EOFAZ保护作用机制，为血管内皮功能失调相关疾病的预防和治疗提供实验基础和理论指导。　　方法：　　（1）EOFAZ保护作用研究分为7组：正常对照组(control，无血清ECM)，模型组（ox-LDL，200mg/L ox-LDL），EOFAZ高剂量组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），EOFAZ低剂量组（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ），阿司匹林组（Asp.，200mg/L ox-LDL+2.5×10-4mol/L Aspirin），卡维地洛组（Car.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L Carvedilol），阿托伐他汀钙组（Atov.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L Atorvastatin Calcium）。　　（2）EOFAZ对细胞迁移与修复作用研究分为4组：正常对照组(control，0.5％ ECM)，模型组（ox-LDL，200mg/L ox-LDL+0.5% ECM），EOFAZ高剂量组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+0.5%ECM），EOFAZ低剂量组（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ+0.5%ECM）。　　（3）MAPK信号研究分为5组：正常对照组(无血清ECM)，模型组（200mg/L ox-LDL），EOFAZ组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制剂组（200 mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），EOFAZ加MAPK抑制剂组（200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059）。　　（4）NOS信号研究分为5组：对照组(无血清ECM)，模型组（200mg/L ox-LDL），EOFAZ组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制剂组（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA），EOFAZ加NOS抑制剂组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。　　（5）MAPK抑制剂Crosstalk调控NOS信号研究实验分为7组：对照组(无血清ECM)，模型组（200mg/L ox-LDL），EOFAZ组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制剂组（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA），p38MAPK抑制剂组（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580），JNK1/2/3抑制剂组（200mg/L ox-LDL+5μmol/L SP600125），ERK1/2抑制剂组（200mg/L ox-LDL+10μmol/L PD98059）。　　（6）NOS抑制剂Crosstalk调控MAPK信号研究分为5组：对照组(无血清ECM)，模型组（200mg/L ox-LDL），EOFAZ组（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制剂组（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），NOS抑制剂组（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。体外培养HAECs，用ox-LDL复制细胞损伤模型，加入EOFAZ、阿司匹林、卡维地洛、阿托伐他汀钙、MAPK或NOS各抑制剂干预保护1h后，继续加入ox-LDL继续作用24h。采用MTT法分析细胞存活率，确定ox-LDL诱导细胞损伤的最佳浓度与时间。倒置显微镜观察细胞损伤形态，吉姆萨(Giemsa)和苏木精-伊红（HE）染色观察细胞损伤病理学特征。划痕试验（Wound scratch assay）进行细胞迁移距离与修复分析，微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell)分析细胞迁移率。分别用酶标仪法、ELISA法分析细胞损伤的乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）含量。化学法检测结构型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）含量。实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，QRT-PCR）检测p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2、iNOS及eNOS mRNA表达水平。蛋白质免疫印迹分析法（Western blot）检测p38MAPK、p-p38MAPK、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、ERK1/2、p-ERK1/2、iNOS及eNOS蛋白表达水平。　　结果：EOFAZ明显提高HAECs损伤的细胞存活率，显著改善细胞损伤病理形态，促进细胞损伤后的迁移和修复，明显提高细胞损伤迁移率，同时能促进NO及eNOS的产生，抑制LDH及iNOS的释放。QRT-PCR分析表明，EOFAZ以及相关抑制剂显著下调iNOS mRNA表达水平，上调eNOS mRNA表达水平(P<0.05)，而对p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2 mRNA表达无显著影响，差异无统计学意义。Western blot结果表明，EOFAZ以及相关抑制剂显著下调p-p38MAPK、p-JNK1/2/3、p-ERK1/2、和iNOS蛋白表达水平，上调eNOS蛋白表达水平(P<0.05)，但对p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2总蛋白表达无显著影响，差异无统计学意义。　　结论：　　(1)EOFAZ对ox-LDL诱导损伤的HAECs发挥保护作用，能促进细胞损伤的迁移和修复，其保护作用机制与抑制 MAPK信号p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2磷酸化以及调控eNOS和iNOS的平衡失常有关。　　(2)ox-LDL诱导HAECs损伤过程中存在MAPK信号与NOS信号crosstalk，为临床血管功能损伤疾患的防治提供新的理论与实验基础。

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0 引 言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 正常HAECs细胞形态

2.2 ox-LDL诱导HAECs损伤的量效-时效关系

2.3 各药物对ox-LDL诱导的HAECs损伤存活率的影响

2.4 EOFAZ对ox-LDL氧化损伤HAECs保护作用形态学分析

2.5 相关指标检测分析细胞损伤

2.6 划痕实验分析EOFAZ对细胞迁移与修复的影响

2.7 Transwell分析EOFAZ对ox-LDL诱导细胞损伤细胞迁移率的影响

2.8 EOFAZ对ox-LDL诱导HAECs损伤p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2、iNOS以及eNOS mRNA表达水平的影响

2.9 EOFAZ对ox-LDL诱导HAECs损伤p38MAPK、p-p38MAPK、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、ERK1/2、p-ERK1/2、eNOS以及iNOS蛋白表达水平的影响

3讨论

3.1 阳性药物的选择

3.2 ox-LDL与血管内皮细胞损伤

3.3 EOFAZ对ox-LDL诱导内皮细胞损伤的保护作用

3.4 EOFAZ对ox-LDL诱导内皮细胞损伤的迁移和修复作用

3.5 EOFAZ对LDH外漏以及细胞损伤形态的影响

3.6 EOFAZ对NOS-NO通路的影响

3.7 EOFAZ对MAPK通路的影响

3.8 MAPK通路与NOS-NO通路Crosstalk调控作用

4 结论

参考文献

综述：MAPKs信号与血管内皮功能损伤

作者简历

致谢

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