基于MAPK信号通路的氧化苦参碱(OMT)改善醛固酮诱导心肌细胞损伤的实验研究

摘要

目的：建立醛固酮（aldosterone,ALD）诱导建立体外SD新生乳鼠心肌细胞损伤模型，观察氧化苦参碱OMT对ALD诱导心肌细胞损伤的干预作用，并进一步阐明其对丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPKs）信号通路中p38MAPK、JNK以及ERK信号的调控，为心肌细胞损伤引起的相关疾病寻找新的治疗靶点。　　方法：采用0.08％胰酶消化法分离制备出生1-3d的SD新生大鼠心肌细胞进行原代培养，差数贴壁1.5h纯化心肌细胞，原代培养前三天加入终浓度为0.1mmol/L5-溴脱氧核苷抑制成纤维细胞的增殖。倒置显微镜下观察心肌细胞培养48h与72 h的形态学变化，免疫细胞化学检测心肌细胞特异性a-横纹肌肌动蛋白（α-actin）、肌钙蛋白(Cardiac Troponin T,c-TnT)表达以鉴定心肌细胞纯度。噻唑兰(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法分析ALD诱导心肌细胞损伤的最佳作用浓度与作用时间。分别设定ALD造模浓度为10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L，作用时间12h、24h、36h研究ALD诱导心肌细胞损伤的量效关系，结合相关文献最后确定ALD浓度为10-5mol/L作用24h作为后续的实验研究。　　实验共分为两个部分：　　（1）确定 OMT对醛固酮诱导心肌细胞损伤的保护作用。实验共分为六组，分别是正常对照组（Ctrl）、模型组（ALD,10-5mol/L）、螺内酯组（Spiro,10-5mol/L）、阿司匹林组（ASP,10-5mol/L）、OMT高剂量组（OMT H,3.78×10-4mol/L）、OMT低剂量组(OMT L,1.89×10-4mol/L)。MTT法检测细胞存活率，乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）外漏测定细胞膜损伤程度，HE、Giemsa染色观察心肌细胞形态学变化情况；　　（2）OMT对醛固酮诱导心肌细胞损伤的保护作用与MAPK信号通路的相关性。实验共分为11个组，分别是Ctrl组、ALD组、Spiro组、ASP组、OMT（3.78×10-4mol/L）组、p38抑制剂组（p38 I,10-5mol/L）、OMT+p38抑制剂组、JNK抑制剂组（JNK I,0.5×10-5mol/L）、OMT+JNK抑制剂组、ERK抑制剂组（ERK I,10-5mol/L）、OMT+ERK抑制剂组。用MTT法检测细胞存活率，蛋白免疫印迹法（Western blot）及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析OMT对ALD诱导p38MAPK、JNK、ERK1/2蛋白及mRNA表达的影响。　　结果：胰酶消化法得到的原代心肌细胞在培养48h后细胞伸出伪足并出现单个细胞或多个细胞成簇搏动，培养72h后，细胞连接成片开始同步搏动。经肌钙蛋白和a-横纹肌肌动蛋白免疫细胞化学鉴定结果显示心肌细胞胞浆中有棕黄色细密颗粒，阳性率达95%以上。　　（1）OMT对ALD诱导心肌细胞损伤的保护作用：MTT和LDH外漏实验结果提示，ALD（10-5mol/L）作用心肌细胞24h后可引起细胞存活率显著降低且LDH外漏明显增加，分别加入Spiro、ASP及OMT干预后与模型组相比，其细胞存活率明显上升且LDH外漏减少(p<0.05)。HE、Giemsa染色显示与正常对照组相比，ALD处理的心肌细胞可引起明显的形态学改变，表现出细胞边界模糊，细胞核居中等变化，加入各干预药处理后，细胞形态趋于正常。　　（2）OMT对ALD诱导心肌细胞损伤的保护作用与MAPK信号通路的相关性：MTT实验结果提示，加入OMT等干预药及相应蛋白抑制剂后均可保护ALD诱导的心肌细胞损伤。Western blotting显示ALD作用心肌细胞24h后可诱导p-JNK及p-ERK1/2蛋白表达上调，通过OMT、Spiro、ASP及相应蛋白抑制剂预处理2h后，可明显抑制ALD诱导的p-JNK、p-ERK1/2增加。此外，与OMT组比较，共处理OMT及ERK1/2 I实验组，p-ERK1/2表达进一步降低，且差异具有显著性。然而，与OMT组比较，共处理OMT及JNK I实验组p-JNK表达未见明显变化。QRT-PCR结果显示，与模型组比较，加入OMT后，对各组基因表达均没有显著改变。　　结论：OMT对ALD诱导的心肌细胞损伤具有保护作用，其作用机制与抑制ERK1/2和JNK蛋白磷酸化密切相关。

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0引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 OMT对醛固酮诱导心肌细胞损伤的保护作用

2.2 OMT对醛固酮诱导心肌细胞损伤的保护作用与MAPK信号通路的相关性

3 讨论

3.1 醛固酮与心肌损伤

3.2 螺内酯对ALD诱导心肌损伤的保护作用

3.3 阿司匹林对心肌的保护作用

3.4 OMT对心肌损伤的保护作用

3.5 OMT对MAPK信号通路的调控作用

4 结论

参考文献

综述:MAPK信号通路调控心肌细胞损伤的病理生理研究

致谢

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