体外培养星形胶质细胞α7尼古丁型乙酰胆碱能受体调控β-淀粉样蛋白聚集的作用

摘要

目的：研究激活星形胶质细胞内的α7尼古丁乙酰胆碱能受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）后对调控β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）聚集的作用。　　方法:分离新生大鼠大脑皮质，培养原代星形胶质细胞并纯化、传代，使用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞及纯度；体外制备Aβ寡聚体；将培养细胞分为对照组、激动剂组、拮抗剂+激动剂组以及 Aβ组、激动剂+Aβ组、拮抗剂+激动剂+Aβ组。激动剂有尼古丁、PNU、s24795，拮抗剂为甲基牛扁亭（methyllycaconitine, MLA）。用蛋白印迹法（Western blotting）和逆转录PCR（reverse transcription, PCR）法检测正常星形胶质细胞内nAChR不同亚单位的表达；蛋白印迹法和凝胶银染方法鉴定 Aβ寡聚体聚集情况；用 CCK-8方法测定星形胶质细胞的存活率；使用蛋白印迹法检测加入激动剂后α7 nAChR的表达以及Aβ蛋白是否降解。　　结果：采用免疫荧光法鉴定所培养的细胞，结果显示星形胶质细胞占所有细胞的95％以上。除β3外，星形胶质细胞中α2、α3、α4、α7及β2 nAChR亚单位在蛋白及mRNA水平均有表达。体外制备的Aβ除了含少量的未聚集的单体（4 kDa)外，主要以二聚体、三聚体、九聚体等不同聚集形式的寡聚体存在；CCK-8方法显示Aβ寡聚体对星形胶质细胞有明显的神经毒性作用，并呈现剂量-效应关系。检测α7 nAChR蛋白表达结果显示：（1）尼古丁组与对照组比较，尼古丁组的α7 nAChR表达明显增高（P<0.01），MLA+尼古丁组与尼古丁组比较，加入拮抗剂组的α7 nAChR表达降低（P<0.05）；（2） PNU组与对照组比较，PNU组的α7 nAChR的表达增加（P<0.05），MLA+PNU组与PNU组相比，α7 nAChR表达降低（P<0.05）；（3）s24795组与对照比较， s24795组的α7 nAChR表达明显升高（P<0.01），MLA+s24795组与s24795组比较，加入拮抗剂组的α7 nAChR表达明显降低（P<0.01）。检测Aβ蛋白的表达结果为：（1）收集细胞的上清液及蛋白，分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达，尼古丁+Aβ组与Aβ组相比，尼古丁+Aβ组的Aβ蛋白表达均明显降低（P<0.01），MLA+尼古丁+Aβ组与尼古丁+Aβ组比较，MLA+尼古丁+Aβ组的 Aβ蛋白的表达均明显升高（P<0.01）；（2）收集细胞的上清液及蛋白，分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达，PNU+Aβ组与Aβ组相比，PNU+Aβ组的蛋白表达均明显降低（P<0.01），MLA+PNU+Aβ组与PNU+Aβ组比较，MLA+PNU+Aβ组的蛋白表达均升高（P<0.05）；（3）收集细胞的上清液及蛋白，分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达，s24795+Aβ组与 Aβ组相比， s24795+Aβ组的 Aβ蛋白表达均明显降低（ P<0.01）， MLA+s24795+Aβ组与s24795+Aβ组比较，MLA+s24795+Aβ组的Aβ蛋白的表达均明显升高（P<0.01）。　　结论：Aβ寡聚体对星形胶质细胞有明显的神经毒性作用。在星形胶质细胞有多种nAChRs亚单位的表达。细胞实验中，使用三种不同的激动剂刺激星形胶质细胞内α7 nAChR，均能够上调α7 nAChR的表达量。星形胶质细胞内的α7 nAChR表达量上调，可能通过协同细胞自身的吞噬作用以及分泌降解酶的作用，降解Aβ。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词表

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1星形胶质细胞的培养及鉴定

2.2星形胶质细胞内受体表达

2.3 Aβ寡聚体的鉴定及对细胞的存活率结果

2.4 蛋白印迹法检测α7 nAChR亚单位蛋白表达

2.5 蛋白印迹法检测Aβ蛋白表达

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述：星形胶质细胞在阿尔茨海默氏病发病机制中的作用

作者简历

致谢

学位论文数据集