六味地黄汤及其活性部位对阿尔茨海默病模型小鼠神经发生的作用研究

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种复杂的神经退行性疾病，本研究从神经发生的角度，以AD模型小鼠和AD患者源诱导多能干细胞分化的神经干细胞(Induced pluripotent stem cells derived Neural stem cell，iPSC-derived NSC)为对象，研究了LW及其活性部位减少脑中神经元丢失的可能机制。　　六味地黄方是宋代名医钱乙为治疗小儿先天肾虚所创，基于此，本研究首先采用免疫荧光技术，观察SAMP8及其对照SAMR1小鼠幼年期神经干细胞的增殖和迁移，为研究LW及其活性部位对幼年AD模型小鼠神经发生的作用奠定基础;其次，采用免疫荧光技术、电生理学技术和学习记忆行为学实验，观察LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠脑中神经干细胞的增殖和分化、突触可塑性以及学习记忆功能的作用，以研究LW及其活性部位对AD模型小鼠神经发生的作用;接着，采用IncuCyte ZOOM活细胞动态成像分析系统以及CCK8法、Caspase3/7测定，观察iPSC-derived NSC的活力、增殖及凋亡，研究文献报道LW成分中可透过血脑屏障成分对神经干细胞生长的作用，以期发现促进神经发生的活性物质;最后，采用尼氏染色、免疫荧光法和BrdU掺入法，观察LW及其活性部位对成年SAMP8和APP/PS1双转基因小鼠脑中神经细胞的数量与神经干细胞的增殖和分化，以研究LW及其活性部位对成年AD模型小鼠神经细胞丢失的作用。　　一、幼年SAM小鼠脑中神经发生变化的研究　　SAMP8小鼠是公认的AD模型小鼠，为了了解SAMP8小鼠在幼年时神经发生的变化，观察了5、15、30、45日龄SAMR1和SAMP8小鼠脑中神经细胞、神经干细胞增殖和迁移的变化。　　1.幼年SAM小鼠脑中细胞增殖变化　　2.幼年SAM小鼠脑中NSC增殖变化　　3.幼年SAM小鼠脑中NSC迁移变化　　二、LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠脑中神经发生的作用　　为了研究LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠神经发生的作用，本研究分别灌胃给予25日龄SAMP8小鼠LW(1.17g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg)47天，以吡拉西坦为阳性药，观察LW、LW-AFC对神经干细胞的增殖与迁移、海马DG区突触可塑性以及学习记忆功能的作用，:　　1.对NSC增殖和迁移的作用　　使用25日龄SAMP8小鼠，LW、LW-AFC、吡拉西坦连续灌胃给药5周后，免疫荧光法观察脑中神经干细胞的增殖和迁移。用EdU/DCX双重标记观察增殖的神经干细胞，结果发现，与SMAR1小鼠比较，SAMP8小鼠脑中神经干细胞的迁移数量无显著性变化，给予吡拉西坦、LW、LW-AFC后，对小鼠脑中神经干细胞的迁移没有影响。用EdU/SOX2双重标记观察神经干细胞的增殖，与SMAR1小鼠比较，SAMP8小鼠脑中神经干细胞的增殖数量显著降低，给予吡拉西坦、LW、LW-AFC后，对小鼠脑中神经干细胞的增殖没有影响。结果表明，吡拉西坦、LW及LW-AFC给药对SAMP8小鼠脑中神经干细胞的增殖和迁移没有影响。　　2.对突触可塑性的作用　　记录海马齿状回区群峰电位发现，与SAMR1小鼠比较，SAMP8小鼠的LTP显著降低。阳性药吡拉西坦和LW-AFC可显著提高SAMP8小鼠的LTP，说明LW-AFC具有增强SAMP8小鼠神经突触可塑性的作用。　　3.对学习记忆功能的作用　　通过新异物体识别实验、避暗实验以及Morris水迷宫实验分别观察LW及其活性部位LW-AFC对SAMP8小鼠物体识别记忆能力、被动回避反应能力、空间学习记忆能力的作用，结果显示，与SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠的物体识别记忆能力、被动回避反应能力、空间学习记忆能力有下降的趋势，但无显著差别。吡拉西坦、LW、LW-AFC对SAMP8小鼠的学习记忆能力无显著作用。　　三、LW中可透过血脑屏障成分对iPSC-derived NSC生长的作用研究　　1.对iPSC-derived NSC活力的作用　　CCK-8检测结果显示，梓醇（1μM、10μM、100μM）对正常人来源iPSC-derived NSC活力具有抑制作用。茯苓酸高浓度（100μM）对AD来源iPSC-derived NSC活力具有抑制作用。　　2.对iPSC-derived NSC增殖的作用　　通过Incucyte活细胞动态成像分析系统观察发现，梓醇（100μM）和茯苓酸(100μM)对AD来源iPSC-derived NSC细胞增殖具有抑制作用。　　3.对iPSC-derived NSC凋亡的作用　　使用Caspase3/7试剂检测细胞的凋亡发现，梓醇（1μM、10μM、100μM）和高浓度阿克苷（100μM）对AD来源iPSC-derived NSC的凋亡具有抑制作用，而较低浓度阿克苷（1μM、10μM）、茯苓酸（1μM、10μM）、獐牙菜苷（1μM、10μM、100μM）和苯甲酸（100μM）对AD来源iPSC-derived NSC的凋亡则有促进作用。　　四、LW及其活性部位对AD模型小鼠脑中神经发生的作用研究　　脑萎缩是AD患者临床神经影像学的重要标志，结果显示，AD患者随着病情逐步进展，脑室体积不断扩大，海马和内嗅区皮质不断萎缩。为了观察LW及其活性部位是否具有减少神经细胞数量的丢失、防止脑萎缩的作用，本研究分别灌胃给予7月龄雄性SAMP8小鼠LW(1.17g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg)及CA-30(1.224g/kg)198天，10月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠LW(10g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg)及CA-30(0.96g/kg)117天，观察脑中神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的数量以及神经干细胞的增殖和分化，结果如下:　　1.对神经元数量的作用　　尼氏染色实验结果显示，与野生型对照相比，APP/PS1双转基因小鼠海马及其CA3区尼氏小体数量减少，给予CA-30可以增加APP/PS1双转基因小鼠海马尼氏小体数量，LW可以增加其海马CA3区尼氏小体数量。　　2.对星型胶质细胞数量的作用　　免疫荧光实验结果显示，与对照组小鼠相比，APP/PS1双转基因小鼠海马中GFAP+细胞数量增加，分别给予LW-AFC和CA-30均可进一步增加APP/PS1双转基因小鼠海马GFAP+细胞数量。　　与SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠海马中GFAP+细胞数量有增加的趋势，分别给予LW、LW-AFC、CA-30对其无影响。　　3.对小胶质细胞数量的作用　　免疫荧光实验结果显示，与对照组小鼠比较，APP/PS1双转基因小鼠海马中Iba1+细胞数量增加，分别给予LW、LW-AFC和CA-30均可减少Iba1+细胞数量。与SAMR1小鼠比较，SAMP8小鼠海马中Iba1+细胞数量增加，分别给予多奈哌齐、LW、LW-AFC可以减少其数量。该结果说明，AD模型小鼠脑中小胶质细胞发生活化，而LW、LW-AFC、CA-30可降低小胶质细胞的活化。　　4.对NSC增殖和分化的作用　　使用BrdU掺入法、SOX2和NeuN免疫荧光法检测受试小鼠脑中的细胞，结果表明，对照组小鼠、APP/PS1双转基因小鼠以及各给药组小鼠脑中均存在SOX2+细胞，说明成年小鼠脑中有神经干细胞。但在对照组小鼠、APP/PS1双转基因小鼠以及各给药组小鼠脑中均未发现BrdU+、BrdU+/SOX2+、BrdU+/NenN+细胞，说明神经干细胞没有增殖与分化。　　通过以上研究，可获得以下结论:　　1.SAM小鼠脑中神经细胞及神经干细胞的增殖随日龄增加而减少，且在5日龄时SAMP8小鼠脑中神经细胞及神经干细胞的增殖已显著少于SAMR1小鼠。　　2.在幼年期，与SAMR1小鼠比较，SAMP8小鼠突触可塑性显著降低，LW-AFC可显著提高SAMP8小鼠的突触可塑性。　　3.LW中可透过血脑屏障成分梓醇和阿克苷可抑制AD来源的iPSC-derived NSC细胞凋亡。　　4.对于AD模型小鼠，LW、LW-AFC、CA-30具有降低脑中小胶质细胞活化和增加神经元数量的作用，且LW-AFC、CA-30可以增加脑中星形胶质细胞的数量。

目录

声明

个人简历

缩略词表

摘要

第一章 幼年SAM小鼠脑中神经发生变化的研究

材料方法

实验结果

一、幼年SAM小鼠脑中细胞增殖变化

一、幼年SAM小鼠脑中NSC增殖变化

三、幼年SAM小鼠脑中NSC迁移变化

讨论

第二章 LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠神经发生的作用研究

材料方法

实验结果

一、LW及其活性部位渐SAMP8小鼠NSC增殖和迁移的作用

二、LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠神经突触可塑性的作用

三、LW及其活性部位对幼年SAMP8小鼠学习记忆功能的作用

讨论

第三章 LW中可透过血脑屏障成分对iPSC-deried NSC的作用研究

材料方法

实验结果

三、对iPSC-derived NSC凋亡的作用

小结

讨论

第四章 LW及其活性部位对AD模型小鼠神经发生的作用研究

前言

材料与方法

实验结果

一、LW及其活性部位对AD模型小鼠脑中细胞数量的作用

二、LW及其活性部位对AD模型小鼠脑中NSC增殖和分化的作用

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文