外泌体lncRNA HCG15在急性心肌梗死中的作用机制研究

摘要

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是因冠状动脉急性、持续性的缺血缺氧所导致的心肌坏死。发病率逐年增加且呈年轻化趋势。因此，寻找心肌梗死治疗的新靶点具有重要意义。　　AMI发生时，由于心肌细胞持续缺氧、ATP缺乏，引起凋亡级联反应激活、心肌细胞坏死。坏死的心肌细胞激活免疫系统，产生剧烈的炎症反应。适当的炎症有利于心肌梗死的修复，而过度的炎症反应造成继发的心肌损伤。TNF等促炎因子往往同时具备损害和保护作用。识别过度的炎症反应、促炎通路激活的生物标记物或许有助于治疗。以往的研究发现[1-3]，外泌体参与AMI的炎症反应过程。AMI产生的外泌体在缺血心肌中迅速被浸润的单核细胞所吸收，加重局部炎症反应。　　大规模的基因组研究发现多个心肌梗死发病易感位点和区段[4-6]，提示AMI的发生发展是环境因素和遗传因素多因素作用的结果。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）广泛参与信号传导，影响细胞代谢、生长、分化、凋亡和死亡等过程，在心血管疾病的发生发展中有重要意义。国内外实验证实了多种lncRNAs在心肌梗死中发挥重要作用[7-9]，参与调节AMI的发生、发展过程。　　然而，外泌体lncRNA在AMI中的研究鲜有涉及，其相关表达谱及在心肌梗死中的作用均并未明了。为此，我们通过RNA测序对AMI患者循环外泌体lncRNA进行筛选，以期发现在AMI中差异表达的lncRNA。通过体外模拟AMI引起的缺氧，利用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)下调目标外泌体lncRNA的表达等技术，观察心肌细胞炎症反应、细胞生长、凋亡等影响，初步研究其可能机制。本研究将有助于揭示外泌体lncRNA在AMI中的作用及可能机制，发现AMI新的特异性标志物，为心肌梗死的治疗提供新的靶点。　　第一部分 急性心肌梗死相关外泌体lncRNA筛选及验证　　目的：　　鉴定AMI患者循环外泌体lncRNA的差异表达情况。　　方法：　　收集6例AMI患者和6例健康成年人（Control组）的外周血，分离外泌体，利用RNA测序技术，建立lncRNA差异表达谱。然后扩大样本量，对兴趣lncRNA的差异表达进行qRT-PCR验证，并和肌钙蛋白作相关分析。　　结果：　　1、分离外泌体，电镜下观察到外泌体呈茶托型或一侧凹陷的半球形，直径为40～200nm。　　2、Western blot检到外泌体表面标记分子：TSG101，CD63和CD63。　　3、提取RNA，利用RNA测序技术，以健康成年人作对照，在AMI患者中找到65个差异表达的lncRNAs，其中上调(fold change＞2，pad-value＜0.05)的有29个，下调(fold change＜-2，padj-value＜0.05)的有36个。　　4、选取5个lncRNAs：STX18-AS1,HCG15(HLA complex group15),LINC00265,NPHP3-AS1和ENTPD1-AS1，在45例AMI患者中进行qRT-PCR检测。　　结果提示，与Control组比较，5个lncRNAs均在AMI组中显著上调。与测序结果符合。　　5、对5个lncRNAs和cTnT作简单相关性分析提示，HCG15的表达水平与心梗标志物cTnT水平正相关(R2=0.5872，p＜0.001)。而多重线性回归分析分析，在α=0.05水准下，只有HCG15进入回归方程。　　结果表明：HCG15表达水平和cTnT水平正相关。　　6、对5个lncRNAs诊断AMI的价值进行ROC曲线分析，HCG15的ROC曲线下面积为0.952[95％可信区间，0.915-0.989]。　　第二部分 LncRNA HCG15的作用及机制研究　　目的：　　探讨外泌体lncRNA HCG15在心肌梗死缺氧模型中的作用及机制。　　方法：　　利用AC16人心肌细胞系模拟心肌梗死缺氧模型，利用siRNA技术抑制lncRNA HCG15的表达，检测细胞生长、凋亡水平;检测炎症因子（IL-6，IL-1β和TNF-α）的表达水平，检测相关信号通路（MAPK，NF-κB等）活性水平。利用信号通路抑制剂，进一步验证上述信号通路是否参与此过程。　　结果：　　一、外泌体介导lncRNA HCG15传递的研究　　1、电子显微镜观察到茶托型或一侧凹陷的半球形，直径为40～200nm外泌体。Western Blot检测到外泌体标记CD63，CD9和TSG101。　　2、缺氧后心肌细胞及外泌体中的HCG15的表达均上升;在外泌体中上升更显著，且在8h时达到峰值。　　3、心肌细胞与缺氧心肌细胞来源的外泌体孵育后，心肌细胞HCG15表达水平上升且在12h升达峰值。　　4、吞噬实验表明心肌细胞摄取PKH67标记的外泌体。　　5、TUNEL法检测到AC16细胞在与Exo-H孵育时细胞凋亡得到增加。　　二、外泌体HCG15对心肌细胞功能影响的研究　　1、转染HCG15siRNA后，siRNA对心肌细胞HCG15的干扰效果达到70％。　　2、与Exo-H孵育后，心肌细胞中HCG15的表达显著增加;而转染HCG15siRNA的心肌细胞和Exo-H孵育后，HCG15的上升被部分拮抗。　　3、MTT分析显示：与Exo-H孵育后，AC16细胞生长明显被抑制;而转染HCG15siRNA后再和Exo-H孵育，生长抑制作用一定程度得到缓解。　　4、TUNEL和流式细胞仪显示，与Exo-H孵育后：AC16细胞凋亡显著增加;但转染HCG15siRNA心肌细胞组，细胞凋亡增加被拮抗。　　5、ELISA法检测结果提示，与Exo-H孵育后：心肌细胞炎症细胞因子IL-6，IL-1β和TNF-α的生成明显增加;转染HCG15siRNA组的炎症因子增加被拮抗。　　三、外泌体HCG15对心肌细胞功能影响的机制初步研究　　l、western blot检测NF-κB通路蛋白及MAPKs通路如p38MAPK、JNK1/2和ERK1/2的表达。与Exo-H孵育后：AC16细胞组的磷酸化NF-κB、p38的表达上调;而转染HCG15siRNA心肌细胞组的上调被拮抗;其他信号分子的表达没有明显变化。　　2、分别用PDTC抑制NF-κb信号通路，PD169316抑制p38MAPK信号通路。在与Exo-H孵育时：AC16细胞生长被抑制;而加入通路抑制剂PDTC或PD169316组，细胞生长抑制被部分拮抗。　　3、TUNEL和流式细胞仪显示，由Exo-H诱导的心肌细胞凋亡，在用PDTC或PD169316处理AC16细胞后观察到凋亡被拮抗的结果。　　4、ELISA法检测到Exo-H诱导的炎症细胞因子水平IL-6，IL-1β，TNF-α升高;而在阻断NF-κB和p38通路后IL-6，IL-1β，TNF-α升高被拮抗。　　结论：　　1、通过RNA测序，在AMI患者循环外泌体中找到65个表达差异的lncRNA，其中上调的29个，下调的36个。经qRT-PCR验证的5个lncRNAs与测序结果一致。　　2、HCG15诊断AMI的ROC曲线下面积为0.952[95％可信区间，0.915-0.989]。简单相关性分析和多重线性回归分析分析均表明，HCG15表达水平和cTnT水平正相关。HCG15可能是AMI的特异性标志物，在AMI中发挥作用。　　3、缺氧AC16心肌细胞分泌的外泌体高表达HCG15;而HCG15通过外泌体途径传递到正常心肌细胞。　　4、HCG15可促进心肌细胞凋亡，促进炎症细胞因子IL-6，IL-1β和TNF-α产生，抑制细胞生长。抑制HCG15的表达可以减轻心肌细胞损伤。　　5、HCG15通过NF-κB和p38通路促进心肌细胞凋亡和炎症细胞因子产生。HCG15上调，NF-κB，P38上调，炎症因子、细胞凋亡均增加，细胞生长抑制;而抑制HCG15或用通路抑制剂抑制NF-κB，P38可拮抗这些效应。缺氧细胞来源外泌体的HCG15通过NF-κB和p38通路介导心肌细胞的损伤。　　综上述，lncRNA HCG15在来自AMI患者血清和缺氧AC16心肌细胞的外泌体中高表达。缺氧细胞来源外泌体的HCG15通过激活NF-κB和p38途径促进心肌细胞凋亡和炎症细胞因子的产生。本研究不仅有助于了解外泌体lncRNA在AMI中的作用及机制，而且为AMI的治疗提供新的治疗靶点。

目录

声明

个人简历

研究生期间科研经历／临床工作经历

摘要

前言

第一部分急性心肌梗死相关外泌体lncRNA的筛选及验证

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分LncRNA HCG15的作用及机制研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

创新点与新发现

局限性

主要英文缩写索引

综述

读博士期间发表的论文及参与的科研

致谢