几种血脂基因多态性与血脂及缺血性心脑血管疾病的关系的研究

摘要

第一部分ACAT-1 rs1044925 SNP与血脂及缺血性心脑血管疾病的关系　　背景:酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1 (ACAT-1)是在正常细胞内以维持胆固醇平衡的一个关键酶，与胆固醇的代谢有着非常密切的关系，因此在血清脂质代谢紊乱以及动脉粥样硬化性疾病的发生、发展过程中起着极其重要的作用。目前 ACAT-1 与血脂水平、动脉粥样硬化性疾病关系的研究主要集中在体外实验及动物模型中进行，而在人体中，ACAT-1基因多态性与血脂代谢及动脉粥样硬化关系的研究较少，且结果不尽一致。开展ACAT-1 基因多态性与人类动脉粥样硬化相关疾病的关系的研究有助于了解ACAT-1在动脉粥样硬化中的作用，对ACAT抑制剂的药物开发具有重要的指导价值。　　目的: 本文旨在探讨 ACAT-1 启动子区域内的单核苷酸多态性(SNP) rs1044925对血脂水平的影响，以及与缺血性心脑血管疾病即冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Heart Disease, CHD)和缺血性脑卒中(Ischemic Stroke, IS)发病风险的关系。　　方法:ACAT-1 rs1044925 SNP的基因分型技术采用聚合酶链反应（PCR）- 限制性片段长度多态性(RFLP)的方法。全部的实验对象还进行了心血管疾病危险因素的流行病学调查和血清脂质水平的检测。根据每个部分实验对象的不同研究分成三个阶段进行。第一阶段：在 626 名广西白裤瑶族和 624 名当地汉族人群中进行，比较广西白裤瑶族与当地汉族人群ACAT-1 rs1044925 SNP基因型及等位基因频率分布的差异，以及两民族人群ACAT-1 rs1044925 SNP与血脂水平关系。第二阶段：在广西汉族的476名高脂血症和 345 名正常血脂人群中进行，比较高脂血症和正常血脂人群ACAT-1 rs1044925 SNP与血脂水平关系的差异。第三阶段：在广西汉族的588名正常对照组，587名经冠脉造影检查确诊的冠心病病人和555名临床确诊的缺血性脑卒中的病人中进行，采用病例-对照的研究设计，比较缺血性心脑血管疾病病例组(CHD，IS)与对照组之间ACAT-1 rs1044925 SNP基因型及等位基因频率分布的差异，并计算ACAT-1rs1044925 SNP与CHD及IS患病风险的关系。　　结果: 1.广西白裤瑶族人群的血脂水平与当地的汉族人群比较差异有统计学意义，白裤瑶族人群的血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白(Apo)A1和ApoB水平明显地低于当地的汉族人群(P ＜ 0.01-0.001)。两民族人群的ACAT-1 rs1044925 SNP基因型和等位基因频率的比较差异具有显著的统计学意义(P ＜ 0.001)，白裤瑶族人群的A和C等位基因频率分别为 79.0%和21.0%，汉族人群中分别为87.3%和12.7% (P ＜ 0.001);白裤瑶族人群中的AA、AC和CC基因型频率分别为63.3%、31.5%和5.2%，汉族人群中分别为75.6%、23.2%和1.1% (P ＜ 0.001)。白裤瑶族的女性人群的ACAT-1 rs1044925 SNP各基因型间的血清TC、LDL-C和ApoB水平的比较差异具有统计学意义，携带有 C 等位基因的个体的血清 TC、LDL-C 和ApoB水平明显地低于非C等位基因携带者。白裤瑶族的男性人群和汉族的男女性人群各基因型间的血脂参数比较差异无显著的统计学意义。两个民族人群血脂参数与环境因素的相关性也存在差异。　　2.高脂血症与正常血脂人群的ACAT-1 rs1044925 SNP基因型及等位基因频率的比较差异无统计学意义。而在高脂血症男性人群ACAT-1 rs1044925 SNP AA与AC/CC基因型者间的血清TC、HDL-C和ApoA1水平的比较差异有统计学意义，AC/CC基因型个体比AA基因型个体有更高的血清TC、HDL-C和ApoA1水平。分层分析显示这种升高HDL-C与ApoA1水平的作用主要存在于高胆固醇血症的男性中，而没有存在于高甘油三酯血症中。在正常血脂人群中，也未发现ACAT-1 rs1044925 SNP与血脂水平的任何关系。　　3. CHD和IS患者的ACAT-1 rs1044925 SNP基因型和等位基因频率与对照组比较差异均有统计学意义。AC/CC 基因型者或携带 C 等位基因者降低CHD (AC/CCvs. AA，P = 0.014；Cvs. A，P = 0.022)和IS (AC/CCvs. AA， P = 0.014; Cvs. A，P = 0.017)的发病风险。在对照组中，ACAT-1 rs1044925 SNP基因型间的血脂水平比较差异也有统计学意义，携带C等位基因的个体比不携带C等位基因的个体有更高的HDL-C水平。　　结论: 在血脂水平存在明显差异的白裤瑶族和汉族人群中， ACAT-1 rs1044925 SNP的基因型分布存在显著差异，ACAT-1 rs1044925 SNP与一般人群血脂水平相关，并可能导致不同群体间血脂水平的差异；在高胆固醇血症中，ACAT-1 rs1044925 SNP AC/CC基因型与增高的HDL-C和ApoA1水平相关，提示ACAT-1 rs1044925 SNP AC/CC基因型在高胆固醇的状态下可能与增加细胞内的胆固醇流出能力有关，从对动脉粥样硬化发生起保护作用；病例-对照研究中ACAT-1 rs1044925 SNP AC/CC基因型与降低的CHD和IS发病风险相关，其原因可能与其对血脂水平的影响有关。　　第二部分SCARB1 rs5888 SNP与血脂及缺血性心脑血管疾病的关系　　背景: 清道夫B族1型受体(SCARB1)是第一个被发现的高密度脂蛋白配体，其对脂质代谢的影响主要是因为参与胆固醇的逆向转运过程，因此对血脂水平以及动脉粥样硬化的发生、发展产生重要的影响。CHD与IS是目前世界上致死率与致残率较高的两个疾病，两种疾病有着共同的病理生理学机制为动脉粥样硬化，其发生均与血脂代谢紊乱密切相关，而关于SCARB1多态性与中国一般人群血脂水平关系的研究较少，其与CHD和IS关系的研究也很少。　　目的:本文旨在探讨SCARB1 rs5888 SNP对广西一般人群血脂水平的影响，进一步探讨SCARB1 rs5888 SNP与CHD和IS的发病风险的关系。　　方法:SCARB1rs5888 SNP的基因分型技术采用PCR-RFLP的方法。在各研究对象中进行SCARB1 rs5888 SNP的基因分型，同时对所有研究对象进行心血管疾病危险因素的流行病学调查及血脂水平的检测。根据各部分实验对象的不同，分成三个阶段开展。第一阶段：在 598 名广西白裤瑶族和585名当地汉族人群中进行，比较两民族之间SCARB1rs5888 SNP基因型及等位基因频率的分布差异，以及各民族群体内SCARB1基因rs5888 SNP基因型之间的血脂水平的差异。第二阶段：在 801个广西仫佬族与807个当地汉族人群中进行，比较两民族SCARB1rs5888 SNP的基因频率的分布差异，验证SCARB1基因rs5888 SNP基因型与血脂水平的关系。第三阶段：在广西汉族601个CHD病人和533个IS病人与广西汉族的582个正常对照组进行，比较病例组与对照组之间基因型频率分布有无差异，并计算SCARB1基因rs5888 SNP基因型与CHD及IS的发病风险的关系。　　结果: 1.广西白裤瑶族与当地汉族人群的血脂水平存在明显差异，白裤瑶族人群的血清TC、HDL-C、LDL-C和ApoA1水平明显低于当地的汉族人群，而ApoB水平则明显高于汉族人群。两民族人群SCARB1rs5888 SNP的基因型及等位基因频率分布也存在显著差异，白裤瑶族人群C和T等位基因频率分别为78.3%和21.7%，汉族人群分别为73.7%和26.3% (P＜ 0.01);白裤瑶族人群CC、CT和TT 基因型频率分别为60.0%、36.6%和3.4%，汉族人群分别为54.2%、39.0%和6.8% (P ＜ 0.01)。两民族人群的TT基因型较CC/CT基因型个体均有更低的血清HDL-C和ApoA1水平。分层分析显示，白裤瑶男性人群TT基因型比CC/CT基因型者有较低的HDL-C和ApoA1水平，女性人群中的T等位基因携带者比非T等位基因携带者有更高的血清TC、LDL-C和ApoB水平。汉族男性人群TT基因型较CC/CT基因型个体有较低的HDL-C和ApoA1水平，但差异尚无统计学意义 (分别P= 0.063和P= 0.086)。另外，两民族人群血脂与环境因素的相关性也存在差异。　　2.广西仫佬族人群的血清ApoB水平高于汉族人群，并且两民族之间基因型频率分布有显著差异。仫佬族人群SCARB1 rs5888 SNP基因型间的HDL-C水平比较差异有统计学意义，TT基因型的个体比CC/CT基因型个体有较低的HDL-C水平。按性别比较时，这种作用主要发现在女性中。汉族人群TT基因型也与降低的HDL-C和ApoA1水平相关，按性别分析时，汉族男性人群血清TG、HDL-C、ApoA1、ApoB水平和ApoA1/ApoB比值在基因型间比较差异有统计学意义，T 等位基因携带者与非 T 等位基因携带者比较有较低的HDL-C、ApoA1水平和ApoA1/ApoB比值, 以及较高的ApoB 水平。TT 基因型比 CC 基因型个体有较高的甘油三酯(TG)水平。汉族人群中，基因与环境的交互作用影响血脂水平，而在仫佬族人群中未发现这种交互作用影响血脂。　　3. CHD患者SCARB1 rs5888 SNP基因型频率与对照组比较差异有统计学意义。与CC/CT基因型个体比较，TT基因型个体有较高的CHD发病风险(TTvs.CC: OR = 1.76,P = 0.038; TTvs. CC/CT:OR = 1.75,P = 0.036)，而IS患者SCARB1 rs5888 SNP基因型频率与对照组比较差异无统计学意义。进一步分析显示在总的病例和对照人群中，TT基因型比CC/CT基因型者有更低的HDL-C水平。而在对照组中，TT基因型较CC/CT基因型者有更高的血清LDL-C和ApoB水平。　　结论: 广西白裤瑶族与当地的汉族人群，广西仫佬族与当地的汉族人群间血脂水平和SCARB1 rs5888 SNP基因型频率比较差异均有统计学意义， rs5888 SNP基因型与血脂水平相关，rs5888 SNP基因型频率的差异可能导致群体间不同的血脂表型；在三个民族人群中证实SCARB1 rs5888 SNP均与降低的HDL-C水平有关，而对TC、LDL-C及ApoB水平的增高作用则有种族及性别特异性；SCARB1 rs5888 SNP TT基因型与增加的CHD风险相关，其可能是通过影响血脂尤其是血清HDL-C 和LDL-C水平实现的。而SCARB1 rs5888 SNP与IS的发病风险无明显相关。　　第三部分MADD-FOLH1 SNPs与血脂及缺血性心脑血管疾病的关系　　背景: 最近的全基因组关联研究(GWAS)发现一些新的影响血脂水平的基因，与传统的血脂相关基因相比，这些基因原本被认为与血脂代谢无明显关系，其与血脂代谢的机制也不被人类所熟知。其中MAP激酶激活的死亡结构域蛋白(MAP-kinase activating death domain, MADD)-叶酸水解酶(Folate hydrolase 1, FOLH1)就是新近发现的与血清HDL-C水平存在关联的基因之一。而流行病学的研究结果显示血脂紊乱为动脉粥样硬化独立的危险因素。　　目的： 探讨MADD-FOLH1区域内几个SNPs与血脂水平的关系，及基因与环境的交互作用对血脂的影响。进一步探讨这些SNPs与缺血性心脑血管疾病（CHD，IS）的关系。　　方法: 采用文献报道与功能位点结合的位点选择策略，选择在 GWAS中与血脂相关联的MADD-FOLH1 rs7395662、rs326214、rs326217、rs1051006、rs3736101和rs7120118 SNPs作为研究位点。基因分型采用Snpshot技术，对研究对象进行基因分型，完成对研究对象的流行病学的调查、血脂水平等生化指标的检测。研究分三步进行：第一步，在 596 名广西汉族非冠心病及脑卒中的正常对照组中进行，比较六个位点各个基因型之间血脂水平的差异。第二步，在缺血性心脑血管疾病病例组（584个CHD病人和555个IS病人）和596个健康对照组中进行，比较各个位点间的基因型或等位基因频率在病例组与对照组中是否存在差异。进一步计算各SNPs基因型与CHD及IS的发病风险的关系。第三步，利用第一、二部材料，析因分析用于确定是否存在基因与吸烟、饮酒和BMI的交互作用对血脂的影响，用logistic回归分析确定是否基因与环境的交互作用同样对缺血性心脑血管疾病产生影响。　　结果: 1.MADD-FOLH1rs7395662 SNP基因型间的血清TG、HDL-C和ApoA1水平比较差异有统计学意义，GG基因型较AG/AA基因型者有较高的TG水平，G等位基因携带者较非G等位基因携带者有更低的血清HDL-C和ApoA1水平。rs326214和 rs3736101 SNPs各基因型间的血脂水平比较差异有统计学意义，rs326214 SNP AA基因型较GG/GA基因型者有更低的血清HDL-C水平, rs3736101 SNP GA/AA基因型者比GG基因型者有着更高的ApoA1/ApoB比值。其余的3个SNPs与血脂水平无相关。经Bonferroni校正后只有rs7395662 SNP与血清TG和HDL-C水平的关系存在显著统计学意义。　　2. CHD和IS组MADD-FOLH1rs7395662 SNP的基因型和等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义。其余五个SNPs的基因型及等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义。Bonferroni校正后，rs7395662 SNP的基因型与冠心病发病风险仍存在统计学意义的模型有：Codominant 模型：GGvs. AA (OR = 0.78, 95%CI: 0.66-0.92，P = 0.0068); Recessive模型：GGvs. AA/GA (OR = 0.63，95%CI: 0.46-0.86，P= 0.0038); Log-additive模型：Gvs. A (OR = 0.78，95%CI: 0.66-0.92，P = 0.003)。rs7395662 SNP的基因型与IS发病风险经Bonferroni校正后仍存在显著意义的有Dominant模型：GA/GG vs. AA (OR = 0.70，95%CI: 0.55-0.89,P = 0.0039)；Log-additive模型：Gvs. A (OR = 0.78，95%CI:0.66-0.91，P = 0.0024)。rs1051006、rs326214、rs326217、rs3736101和rs7120118 SNPs与CHD及IS的发病风险无相关，但它们之间存在连锁不平衡。对这五个位点进行单倍体分析时发现：与单倍体A-G-T-G-C比较，G-G-T-G-C有1.59倍高的CHD风险 (P = 0.026)，但总体的P值尚无显著的统计学意义 (P = 0.099)。在IS组中，与A-G-T-G-C比较，G-A-T-G-C有1.95倍的IS的发病风险 (P = 0.039)。但总体的单体型与IS的发病风险P值尚无统计学意义 (P = 0.13)。　　3.发现六个 SNPs的基因型与吸烟、饮酒及BMI存在不同程度的交互作用对血脂水平产生影响。经过Bonferroni校正后仍然有统计学意义的有：rs7395662与饮酒的交互作用对血清TG和HDL-C水平的影响，分层分析显示rs7395662 SNP基因型对TG水平的影响主要出现在不饮酒者，GG较AA/AG基因型者有更高的TG水平。而rs7395662 SNP基因型对血清HDL-C水平的影响主要出现在饮酒组，AA 较 AG/GG 基因型者有较高的 HDL-C水平。rs7395662 SNP与吸烟的交互作用对血清TG水平有影响，rs7395662 SNP基因型对TG的影响主要出现在吸烟者，GG较AA/AG基因型者有更高的TG水平。rs326214和rs326217 SNPs与饮酒的交互作用对血清TG存在影响，基因型对血清TG的影响主要体现在饮酒人群中，突变的纯合子较野生型纯合子和杂合子有更高的血清TG水平。rs3736101 SNP基因型与吸烟、饮酒的交互作用对血清 HDL-C 水平有影响，其基因型对血清 HDL-C水平的影响主要体现在吸烟或饮酒人群中，突变等位基因携带者与野生型纯合子者相比有较高的HDL-C水平。rs7120118 SNP与饮酒的交互作用对血清 TG 水平有影响，分层分析在饮酒与不饮酒组中未发现基因型与血清TG水平有关。rs1051006 SNP与BMI的交互作用对血清LDL-C产生影响，在BMI ＜ 24的人群中，基因型之间的血清LDL-C水平无差异，而在BMI≥ 24人群中，基因型之间的血清LDL-C水平存在显著差异，GG较AA/AG基因型者有较低的血清LDL-C水平。　　4.发现MADD-FOLH1rs3736101 SNP基因型与饮酒之间的交互作用对CHD产生影响 (P = 0.0021)。rs3736101 SNP与CHD的关系在饮酒与不饮酒人群中存在着相反的趋势，在不饮酒人群中，GA/AA基因型比GG基因型个体有较高的CHD风险，但是这种风险未达到统计学显著意义（OR = 1.68，95%CI: 0.99-2.86）。而在饮酒人群中，GA/AA较GG基因型者有降低的CHD风险 (OR = 0.33, 95%CI:0.12-0.89)。其余SNPs未发现与环境的交互作用对CHD及IS有影响。　　5. 分析单倍体与饮酒之间的交互作用对CHD及IS的风险时，检测到由rs1051006、rs326214、rs326217、rs3736101和rs7120118 SNPs构建的单体型与饮酒之间存在交互作用对CHD的影响(P = 0.00041)。单倍体与饮酒的交互作用对IS的影响未达到统计学差异(P = 0.061)。　　结论:FOLH1 rs7395662 SNP与血清增高的TG，及降低的HDL-C和ApoA1水平相关，其对血脂的影响有促动脉粥样硬化作用；病例-对照研究中rs7395662 SNP与降低的CHD和IS的发病风险相关，rs7395662 SNP与血脂和疾病的关系不存在一致性，rs7395662 SNP这种与降低的疾病风险的作用可能不是通过血脂水平起作用；rs326214 ， rs326217 ， rs1051006 ， rs3736101 和 rs7120118 五个 SNPs 经校正后未发现与血脂水平存在显著相关，但单体型分析显示其单倍体可能与CHD及IS发病相关；MADD-FOLH1 SNPs与吸烟、饮酒及BMI存在交互作用对血脂水平有影响，而这种SNPs与饮酒的交互作用对血脂水平的影响也可能同样会导致疾病发病风险的改变，单体型也与饮酒存在交互作用对疾病发病风险产生影响。

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