糖多孢红霉菌A226-YA突变体构建及产物分析

摘要

红霉素(erythromycin)是一类广谱大环内酯类抗生素，主要由糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)合成。同其它抗生素一样，红霉素在临床上也出现了许多耐药病原菌，开发针对耐药性细菌的新药已非常迫切。现在推向市场的第三代红霉素-酮内酯类(ketolides)抗生素是使用化学方法对红霉素结构进行修饰完成。其结构上最大的特点将内酯环C-3位的L-克拉定糖(L-cladinose)替换成了羰基。因为羰基能避免诱导大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B(macrolide-lincosamide-streptograminB，MLSB)抗性，所以能大大提高对某些红霉素抗性菌的活性。随着分子生物学的发展和对抗生素生物合成过程分子机制的认识深入，组合生物合成方法渐渐成为探索合成新抗生素的方法之一。 红霉素生物合成分为两步：母核的合成及后修饰。母核的合成是以聚酮合成酶(polyketidesythase，PKS)来完成的。PKS是个复合酶系，由六套结构和功能相近的模块组成。红霉素母核中C-3位羟基是由模块6中KR6酶域决定的。用基因工程方法对KR6酶域的DNA序列进行敲除或替换可能会全部或部分地使KR6失活，使C-3位羟基变为酮基。位于KR6酶域催化活性中心的Tyr2699是个关键性氨基酸残基，突变Tyr2699可以使KR6完全使活。本文通过同源重组方法突变KR6酶域Tyr2699的密码子，构建可以合成DOEB而减少红霉素合成的糖多孢红霉菌A226突变体。 为了将KR6中催化三联体中Tyr2699(Y)密码子TAC换成Ala(A)密码子GCC，并保证有效的染色体整合和二次重组，突变位点两侧同源片段长度保持约500bp。以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，用PCR技术扩增出突变位点两侧DNA片段。然后再用重叠PCR技术将扩增出其合成基因KR6酶域及其附近酶域中的Tyr2699密码子TAC突变为Ala密码子GCC的大约1000bpDNA同源序列，克隆到载体pWHM3上，构建了同源重组质粒pWHM3-YA。将pWHM3-YA转化到糖多孢红霉菌A226原生质体中，然后筛选出pWHM3-YA整合到红霉素合成基因上的整合体A226-pWHM3-YA-A和A226-pWHM3-YA-B。将筛选得到的整合体A226-pWHM3-YA-A在无硫链丝菌肽(Thiostrepton，Thio)的R3M斜面上至少生长两代后，制备成原生质体涂R3M平皿，对不能在含Thio的R3M斜面上生长并无枯草杆菌抑制效应的菌株进行DNA序列分析，获得了糖多孢红霉菌A226的突变菌株A226-YA-A和A226-YA-B。ZabspecFab质谱分析证实了A226-YA-A突变体合成了DOEB，没有红霉素的合成，至此，获得了糖多孢红霉菌A226的突变菌株A226-YA。质谱图上未检测到红霉素的734m/z离子峰，说明KR6酶域催化活性位点的Tyr2699是个重要的氨基酸残基，其侧链酸性酚羟基是个关键的质子供体功能基团，突变Tyr2699可以完全使KR6失活；也未有2-脱甲基-3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B351.1m/z的离子峰，说明在糖多孢红霉菌中进行染色体突变，可以避免不必要的副产物产生。 突变体A226-YA合成的3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量仍然很低。为了探讨影响DOEB生物合成产量的因素，对糖基转移酶和合成酶基因功能进行了分析，来证明二次重组是否改变了除已测序之外其它DNA的结构。将EB作为补充物添加到A226-YA发酵液中时，发酵液能够抑制枯草杆菌，薄层层析也证明A226-YA能够将向培养基中添加的EB转化成红霉素，说明糖基合成酶和转移酶都保持完整，整个重组过程没有破坏糖多孢红霉菌A226染色体的其它合成基因和后修饰基因结构。那么染色体突变后菌体合成的DOEB产量低的可能情况有三种：一是即使改变KR6的1个氨基酸也可能使巨酮合成酶的空间结构改变，从而影响到巨酮合成酶活性；二是突变体合成的DOEB为B-酮长链脂肪酸产物，不是TE酶最佳底物，使TE催化反应的效率降低；三是染色体结构的改变使突变基因转录的mRNA或翻译的蛋白酶对菌体来说是个异源体，被菌体自身的酶系统降解。具体是什么原因需要进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

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缩略词表

第一部分引言

第二部分材料与方法

第三部分结果和讨论

第四部分总结

论文参考文献

附录

综述大环内酯类抗生素糖基的生物学功能及生物学功能

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文