HMGB1/TLR4/TRAF6/NF--κB介导自噬在高糖预培养hiPSCs--CM缺氧复氧损伤中的作用机制研究

摘要

缺血心肌在梗死相关血管开通后可能导致比血管闭塞时更严重的急性损伤，这种再灌注后自相矛盾地加重组织损伤被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。今天尽管冠状动脉介入治疗策略取得了显著进展，但糖尿病仍然与急性心肌梗死后较高的死亡率有关。该疾病增加了心肌对缺血再灌注损伤的易感性，也通过阻断或激活细胞内信号通路来改变心肌对缺血预处理策略的反应，从而降低了细胞对死亡的抵抗力。糖尿病带来的改变成为了糖尿病患者急性心肌梗死后不良预后的基础。　　自噬是一种进化上的保守机制，细胞内蛋白和细胞器通过被称为自噬体的双膜囊泡隔离并被递送至溶酶体进行降解。发生在基础水平的自噬参与维持细胞的稳态，但自噬也可以被进一步由应激诱导，从而介导细胞中的保护性或损伤性功能。　　高迁移率族蛋白B1（high mobility group box1，HMGB1）广泛存在于哺乳动物体内，通过受损、凋亡、坏死细胞主动分泌和被动释放的方式发挥调节基因转录，参与DNA修复，介导炎症反应等生物学效应。HMGB1是否通过相关信号通路调控自噬介导了高糖条件下的缺血再灌注损伤有待进一步研究。　　人多能诱导干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes,hiPSCs-CMs)由可由体细胞诱导分化而来，避免了直接获取人类原代心肌细胞产生的损伤及伦理问题，更好的模仿人体心肌细胞的生理状态，得到更加客观的实验结果。　　本研究通过构建高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧(Hypoxia reoxygenation，H/R)模型，模拟糖尿病患者体内心肌缺血再灌注损伤环境，在细胞及分子水平上观察缺氧复氧后心肌自噬水平的变化规律和特点，探讨缺氧复氧致高糖预培养缺氧复氧后心肌损伤与心肌自噬水平变化间的内在联系，揭示HMGB1及心肌自噬在该条件下致心肌损伤中的生理及病理功能，明确其对心肌损伤的具体作用。　　第一部分高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧模型的建立　　目的:使用人体尿液细胞重编程后获取hiPSCs，分化得到hiPSCs-CM后建立高糖预培养缺氧复氧模型。　　方法:收集健康男性志愿者尿液，分离培养原代尿液细胞。使用含有Oct，Sox2，Klf4和c-Myc四个重编程因子的仙台病毒转染原代尿液细胞，获得hiPSCs。对获得的hiPSCs采用体外拟胚体分化、体内畸胎瘤成瘤、免疫荧光染色等方法鉴定所获得的细胞系具有多能性。采用的化学成分明确的小分子定向诱导心脏分化策略，使用仅包含三种化学成分的培养基（基础培养基RPMI1640，1-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白）和小分子定向诱导，分化hiPSCs得到hiPSCs-CM。采用免疫荧光染色及流式细胞术鉴定所获得的心肌细胞。对获得的hiPSCs-CM进行高糖预培养及缺氧复氧建模，采用CCK8等方法对建模进行评估。　　结果:1.成功建立一株具有多潜能的人体尿液细胞来源hiPSCs。　　2.在使用无动物源成分小分子定向诱导心肌分化策略得到的心肌细胞具有完整的肌丝肌节结构，在纯化培养后其纯度能达到95％以上。　　3.在25mM、35mM、45mM葡萄糖浓度CDM3高糖培养24h下，hiPSCs-CM细胞活性不会减低(P＞0.05)。　　结论:35mM葡萄糖浓度培养基预培养hiPSCs-CMs24h后缺氧2h复氧2h后心肌细胞活力明显下降。　　第二部分自噬在高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧损伤中的作用　　目的:研究hiPSCs-CM在高糖预处理后的自噬水平与心肌细胞线粒体功能、凋亡等损伤标志的关系。　　方法:采用的化学成分明确的小分子定向诱导心脏分化策略，使用仅包含三种化学成分的培养基（基础培养基RPMI1640，1-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白）和小分子定向诱导，分化hiPSCs得到hiPSCs-CM，持续培养30天后根据第一部分所得条件建立高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧模型。采用自噬双标腺病毒检测自噬流、qPCR检测自噬相关指标mRNA表达量、Western blot检测自噬相关蛋白表达量;采用JC-1染色、线粒体DNA(mtDNA)、Mitotracker染色、Mitosox染色检测线粒体相关功能;采用qPCR检测凋亡相关基因mRNA、Westernblot检测凋亡相关蛋白表达。　　结果:1.自噬双标腺病毒检测自噬流:H/R组比CON组RFP光点数增加，35H/R组比35CON组RFP光点数增加，35H/R组RFP光点比H/R组明显增加(P＜0.05)　　2.BECN1-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组明显增加(P＜0.05)。SQSTM1-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。LC3-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。　　3.BECN1蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组明显增加(P＜0.05)。SQSTM1蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量显著降低(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组降低(P＜0.05)。LC3Ⅱ蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著加(P＜0.05)。　　4.JC-1染色:35H/R组比35CON组相对荧光强度比值降低（P＜0.01）。35H/R组相对荧光强度比值比H/R组明显降低(P＜0.05)。　　5.线粒体DNA(mtDNA)检测:35H/R组比35CON组mtDNA平均拷贝数降低(P＜0.05)。35H/R组mtDNA平均拷贝数比H/R组明显降低(P＜0.05)。　　结论:高糖预培养组hiPSCs-CM在缺氧复氧后自噬水平明显增加高于正常培养的心肌细胞，且该组细胞线粒体损伤、凋亡最为严重。　　第三部分HMGB1/TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路调控自噬参与高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧损伤　　目的:研究HMGB1/TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路在高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧模型中的激活情况及其介导心肌损伤的具体作用机制。　　方法:采用的化学成分明确的小分子定向诱导心脏分化策略，使用仅包含三种化学成分的培养基（基础培养基RPMI1640，1-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白）和小分子定向诱导，分化hiPSCs得到hiPSCs-CM，持续培养30天后根据第一部分所得条件建立高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧模型。采用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin及自噬抑制剂3-MA对高糖预培养缺氧复氧组hiPSCs-CM进行干预。采用CCK8检测抑制剂作用浓度与效果;分别用采用免疫荧光染色检测自噬流、qPCR检测信号通路相关指标mRNA表达量、Western blot检测信号通路相关蛋白表达量;流式细胞术检测细胞凋亡水平。　　结果:1.HMGB1/TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路相关基因mRNA表达量检测:HMGB1-mRNA:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组明显增加(P＜0.05)。TLR4-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.01)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.01)。TRAF6-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H瓜组明显增加(P＜0.05)。NF-κB-mRNA表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。　　2.信号通路相关基因蛋白表达水平检测:HMGB1蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。TLR4蛋白表达水平:35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。TRAF6蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。NF-κB蛋白表达水平:35H/R组比35CON组表达量增加(P＜0.05)，35H/R组表达量比H/R组显著增加(P＜0.05)。　　3.免疫荧光染色检测HMGB1:H/R组及35H/R细胞胞浆内出现HMGB1蛋白特异性荧光，35H/R组比H/R组胞浆内荧光表达量增加(P＜0.05)。　　4.CCK8检测细胞活性确定抑制剂效果:Gly(0.15μM)组和3-MA(10mM)组均改善了高糖缺氧复氧细胞损伤(P＜0.05)，而Gly组和3-MA组细胞活力和H/R组无差异。　　结论:高糖的条件激活了HMGB1/TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路，而该信号通路过度的激活自噬造成了心肌细胞的损伤。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

参考文献

第一部分高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧模型的建立

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第二部分自噬在高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧损伤中的作用

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第三部分HMGB1／TLR4／TRAF6／NF-κB信号通路调控自噬参与高糖预培养hiPSCs-CM缺氧复氧损伤

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

结论

附录：中英文缩略词对照表

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文