CK1抑制剂对牛卵母细胞体外成熟的影响

摘要

哺乳动物卵母细胞的体外成熟是核移植、转基因动物等胚胎工程技术的基础和关键技术环节之一。虽然卵母细胞的体外成熟技术研究已经取得了长足进展，但由于卵母细胞体内外生长发育的生理环境不同，导致卵母细胞的体外成熟效率远低于体内成熟。CK1是细胞有丝分裂和Wnt/β-catenin信号通路中的关键激酶，影响细胞的增殖分化。本研究探讨了CK1的抑制剂D4476对牛卵母细胞体外成熟效率的影响及其作用机制，以便为完善牛卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据。　　首先，探讨了D4476对牛COCs的卵丘细胞扩展、体外成熟及其随后胚胎发育潜能的影响。黄牛COCs经含不同浓度D4476(0、2、5、10、20μmol/L)的成熟培养液培养24h后，2μmol/L和5μmol/LD4476处理组的卵丘细胞扩展平均分值与对照组差异不显著(2.57、2.67vs2.68，P＞0.05)，而10μmol/L、20μmol/L D4476处理组的卵丘细胞扩展平均分值显著低于对照组(1.92、1.26vs2.68，P＜0.05);5μmol/L和10μmol/L D4476处理组的卵母细胞成熟率显著高于对照组（70.15％、73.94％vs53.65％，P＜0.05），2μmol/L和20μmol/LD4476处理组的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著(62.77％、67.85％vs53.65％，P＞0.05)。各成熟培养处理组的卵母细胞经体外受精后发现，2μmol/L和5μmol/L D4476处理组的卵母细胞体外受精分裂率与对照组差异不显著(70.90％、73.52％vs69.43％，P＞0.05)，10μmol/L和20μmol/L D4476处理组的分裂率显著低于对照组(59.17％、48.57％vs69.43％，P＜0.05);2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L D4476处理组的囊胚发育率显著高于对照组(20.05％、28.00％、19.72％vs15.67％，P＜0.05)，20μmol/L D4476处理组的囊胚发育率与对照组差异不显著（14.71％vs15.67％，P＞0.05）。　　其次，探讨了D4476影响牛卵母细胞体外成熟效率的作用机制。实时荧光定量PCR和PI染色检测分析发现，5μmol/L D4476处理组的卵母细胞CK1表达量显著下降(P＜0.05)，但对卵母细胞核形态没有影响;Wnt信号相关基因β-catenin和Cx43表达无显著变化(P＞0.05)，TCF-4的表达显著提高(P＜0.05)。5μmol/L D4476处理组的卵丘细胞凋亡基因Bad表达无显著变化(P＞0.05)，Wnt信号相关基因β-catenin、Cx43和TCF-4，增殖基因CTSB和MAPK，扩展基因PTGS-2、PTX-3和TGS-6，凋亡基因Bax以及抗凋亡基因Bcl-2的表达显著升高(P＜0.05)。Western Blot检测结果显示，5μmol/L D4476处理组的卵丘细胞Cx43蛋白表达在体外成熟过程中下降，在成熟后升高。　　以上结果表明，成熟培养液中添加5μmol/L D4476能够提高黄牛卵母细胞体外成熟效率及其随后的胚胎发育能力，这一作用可能是D4476抑制了参与卵母细胞自发减数分裂的CK1的表达，提高核内转录辅助因子TCF-4的表达;同时，模拟Wnt信号，促进卵丘细胞的增殖、扩展，延缓卵丘细胞的凋亡而实现。

目录

声明

摘要

英文缩略词

第一部分 文献综述

1 卵母细胞体外成熟的研究进展

1．2 卵子的发生的过程

1．3 卵母细胞体外成熟的影响条件

2 CK1和Wnt／β-catenin信号通路对卵母细胞成熟的影响

2．2 CK1和Wnt／β-catenin信号通路的关系

2．3 Wnt／β-catenin信号通路对卵母细胞成熟的影响

3 缝隙连接蛋白对卵母细胞成熟的影响

3．1 缝隙连接蛋白的简介

3．2 缝隙连接蛋白43对卵母细胞成熟的影响

4 CK1抑制剂对卵母细胞成熟影响

4．2 CK1抑制剂对卵母细胞成熟的影响及调控机制

5 研究的目的及意义

第二部分试验研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据处理分析

2 结果

2．1 不同浓度D4476对黄牛COCs体外成熟中卵丘细胞扩展的影响

2．2 不同浓度D4476对黄牛COCs体外成熟及随后胚胎发育的影响

2．3 D4476对黄牛卵母细胞内CK1表达及卵母细胞核形态的影响

2．4 D4476对Wnt／β-catenin信号相关基因表达的影响

2．5 D4476对卵丘细胞内增殖、扩展、凋亡基因表达的影响

2．6 D4476对卵丘_幺mBg内Cx43蛋白表达变化的影响

3 分析与讨论

4 结论

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及专利