水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究

摘要

本研究以水牛胎儿四肢长骨骨髓为分离对象，采用全骨髓贴壁法分离培养水牛胎儿骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，首先比较了不同胎儿大小和不同血清浓度对水牛胎儿BMSCs增殖效果和分化情况的影响，并对所分离得到的细胞进行生物学特性鉴定;同时探讨了水牛胎儿BMSCs分别培养在常氧条件(20％O2)和低氧条件(5％O2)下细胞表面抗原、间质标记基因、应力纤维和核型的变化情况;另外，还比较了水牛胎儿BMSCs和水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)用不同转染试剂对其转染效果的影响，以期建立一套稳定的水牛胎儿BMSCs分离培养体系和高效转染外源基因的方法。研究结果如下:　　(1)随着培养基中血清浓度的增加，细胞增殖速度加快;细胞周期检测试验发现15％血清浓度中处于G0/G1期的细胞比例最小(35.8％vs52.4％，P＜0.01;35.8％vs51.6％，P＜0.01)，10％血清浓度和20％血清浓度的差异不显著（52.4％vs51.6％，P＞0.05）;但从细胞形态来看随着血清浓度的增加，胞质内出现钙沉积的细胞数量也随之增多。分离自不同大小胎牛的水牛胎儿BMSCs培养在10％血清浓度的培养基中，细胞形态无明显区别均与典型的MSCs细胞形态相似。细胞生长曲线均成“S”型，增殖速率与细胞代数和胎牛大小有关:10cm以下的水牛胎儿不易分离得到其骨髓，10cm～17cm的胎牛来源的BMSCs在3代以内随着代数的增加增殖速度加快，传至4代后，其增殖速度随着代数的增加而下降;17cm以上胎牛来源的BMSCs其增殖速率，第2代高于第1代细胞，第3代开始下降且低于第1代细胞。　　(2)对所分离得到的水牛胎儿BMSCs进行生物学特性鉴定发现:RT-PCR检测到第3代细胞表达oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、CD90、CD105等细胞表面抗原。免疫荧光分析发现第3代细胞表达OCT4、Nanog和CD73。流式细胞仪检测结果显示:第3代、第5代、第10代、第15代和第20代细胞的CD29和CD44的阳性率均大于95％，造血干细胞表面抗原CD45和内皮细胞表面抗原CD31的阳性率均小于2％。体外诱导分化试验表明第3代细胞可以被定向诱导分化为成骨细胞和成脂细胞。　　(3)在常氧培养条件下，水牛胎儿BMSCs随着培养代数的增加，CD29+阳性细胞比例逐渐下降;细胞内应力纤维合成受阻，细胞形态由梭形逐渐转变成多边型;培养至10代后，间质细胞标记(mesenchymal marker)基因:snail、slug、fn1、N-Cadhering mRNA的表达水平下降。然而，在低氧培养条件下，免疫荧光染色结果显示:细胞内的低氧诱导因子1、2(HIF-1、HIF-2)的表达被激活，其下游基因twist的表达量亦随之升高，与此同时间质标记基因snail、slug、fn1、N-Cadhering、col1a的表达量亦随之升高;细胞黏附试验表明，低氧条件下细胞的黏附性较于常氧条件下更小，更具有间质细胞特性;细胞免疫荧光染色亦表明:在低氧条件下，水牛胎儿BMSCs的应力纤维较在常氧下合成更稳定，表达量更高。培养于低氧条件下的P3、P10和P20水牛胎儿BMSCs核型分析统计结果表明随着细胞代数的增加，核型正常率下降，培养于低氧条件下的P10、P20细胞核型正常率高于常氧条件下的　　(4)在转染试剂相同的情况下，相同代数的水牛胎儿BMSCs转染效率显著高于BFFs(15.6％±0.17＞13.3％±0.13，P＜0.05;23.9％±0.21＞19.1％±0.22，P＜0.05);转染同一种细胞的情况下，转染试剂LipofectamineTM3000的转染效率显著高于Roche(R) X-tremegene（19.1％±0.22＞13.3％±0.13, P＜0.05;23.9％0.21＞15.6％±0.17，P＜0.05）。在此基础上利用LipofectamineTM3000将带有催乳素(PRL)基因的质粒分别转染了相同代数的水牛胎儿BMSCs和BFFs，水牛胎)BMSCs转染效率同样显著高于BFFs（18.5％±0.19＞16.4％±0.14，P＜0.05）;PCR检测结果显示转染的细胞有PRL基因整合。　　结论:(1)从10～17cm长的水牛胎儿长骨分离的骨髓利用全骨髓贴壁法可以分离得到具有间充质干细胞特性的BMSCs;(2)水牛胎儿BMSCs在10％的血清浓度和低氧(5％O2)条件下体外培养，细胞中HIF-Twist轴被激活，其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fn1和col1a1表达量升高，从而有助于BMSCs维持其间质干细胞的特性和更稳定的核型;(3)在质粒和转染试剂相同的情况下，水牛胎儿BMSCs的转染效率显著高于BFFs。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1 骨髓间充质干细胞的分离培养

1．1 骨髓间充质干细胞的来源

1．2 成年MSCs和新生儿或胎儿MSCs

1．3 MSCs的鉴定

2 BMSCs在培养过程中的问质上皮转变的分子机制及其调控

2．1 BMSCs在体外培养过程中的MET

2．2 低氧条件与EMT

2．3 低氧条件对BMSCs的影响

3 BMSCs的应用

3．1 BMSCs应用于核移植

第二章 水牛胎儿骨髓闻充质干细胞分离培养及生物学特性鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 试剂配制

1．4 实验仪器

1．5 水牛胎儿骨髓间充质干细胞和胎儿成纤维细胞原代培养

1．6 水牛胎儿骨髓间充质干细胞传代培养

1．7 水牛胎儿骨髓间充质干细胞冻存与复苏

1．8 水牛胎儿骨髓间充质干细胞的形态观察及生物学特性研究

1．9 水牛胎儿骨髓间充质干细胞的生物学特性鉴定

1．10 数据分析

2 结果

2．1 水牛胎儿BMSCs的原代培养

2．2 不同大小水牛胎儿对BMSCs分离效果和细胞增殖的影响

2．3 不同血清浓度对水牛胎儿BMSCs增殖和分化的影响

2．4 水牛胎儿BMSCs的生物学特性鉴定

3 分析与讨论

4 小结

第三章 低氧条件对水牛胎儿BMSCs培养效果的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 试剂配制

1．4 实验仪器

1．5 水牛胎儿BMSCs常氧条件下细胞表面抗原、间质标记基因、应力纤维表达变化和核型的研究

1．6 低氧条件对水牛胎儿BMSCs培养效果的影响

2 结果

2．1 水牛胎儿BMSCs常氧条件下细胞表面抗原变化的研究

2．2 水牛胎儿BMSCs常氧条件下应力纤维变化的研究

2．3 水牛胎儿BMSCs常氧条件下间质标记基因表达量变化的研究

2．4 水牛胎儿BMSCs常氧条件下核型变化的研究

2．5 水牛胎儿BMSCs低氧条件下的研究

3 分析与讨论

4 小结

第四章 水牛胎儿BMSCs转染条件的摸索

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 实验仪器

1．4 水牛胎儿BMSCs的分离和培养

1．5．水牛胎儿成纤维细胞原代培养

1．6 水牛胎儿成纤维细胞传代培养

1．6 无内毒质粒的制备

1．7 水牛胎儿BMSCs和BFFs的转染试验

1．8 流式细胞仪检测细胞转染效率

1．9 PCR检测

1．10 数据分析

2 结果

2．1 转染条件的摸索

2．2 转染PRL目的基因

3 分析与讨论

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

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