血管内皮生长因子对大鼠卵巢组织自体移植后的形态与功能的影响

摘要

卵巢在女性既承担着延续后代的生育功能，同时还担负着重要的女性内分泌功能。随着医学技术的进步，许多肿瘤、严重血液病或者自身免疫性疾病得到了治愈，但她们的卵巢功能由于化学或物理治疗而遭到了严重损害或衰竭，卵巢功能不足会造成月经稀发、闭经、第二性征不发育或发育迟缓、不孕、早绝经、心血管系统疾病以及骨质疏松等，严重影响了她们的生活质量。这就使得卵巢功能的保护和生育能力的保存越来越受到重视，保存女性生殖能力的方法应运而生，主要有以下几种：药物保护卵巢、胚胎冷冻、卵子冷冻、卵巢组织冷冻保存与移植。 卵巢组织冷冻几乎成为一种近乎理想的大量保存始基卵泡的方法，比胚胎和卵子冷冻保存更具有潜力。主要是因为卵巢组织中以始基卵泡为主，始基卵泡的许多特征使其不易受到冷冻伤害。因此，卵巢组织的冷冻保存是一种很有发展前景的保护卵巢功能的方法。 冷冻技术目前有以下两种：慢速冷冻和玻璃化冷冻。慢速冷冻法，主要是通过缓慢的降温速度和人工植冰对细胞进行较充分的脱水来减少细胞内冰晶形成。但是卵巢组织不同于胚胎和卵子，其组织结构致密而且含有多种不同类型的细胞，对冷冻平衡要求各不相同且差异较大，使得慢速冷冻过程中对组织细胞脱水不够充分，难以完全避免冰晶形成，从而影响慢速冷冻在卵巢组织冷冻保存中的推广应用。 玻璃化冷冻：是近年来出现的一种新的冷冻方法。即将卵巢组织片放置在较高浓度冷冻保护剂中平衡一段时间，利用高浓度的冷冻保护剂渗透入细胞内极大地提高胞浆粘稠度，而后直接投入-196℃的液氮中快速降温，使卵巢组织在极短时间内无法形成冰晶而直接形成“玻璃样”固态，始终保持细胞溶液中水分子和离子的原始分布，减少甚至避免细胞内外冰晶形成，减轻溶质损伤。是一种操作简单、仪器设备要求低、较有前途的一种冷冻方法。Al-aghbari等报道：羊的卵巢组织用乙二醇(EG)作冷冻保护剂进行玻璃化冷冻，冷冻复温的卵巢组织中获得的卵子与新鲜卵巢组织中获得卵子的体外存活率无明显差别。 尽管有很多实验表明，移植后的卵巢可以在宿主动物体内生存并且有卵泡的生长发育，但是，还有许多问题有待解决，比如：缺血再灌注损伤，它是移植后卵巢组织存活最大的威胁，有报道认为大部分窦前卵泡的死亡主要是由于缺血再灌注损伤造成，而不是由于冷冻损伤所致。因此，怎样有利于血管生成以及避免缺血再灌注损伤成为移植中的关键问题。由此我们就想到了最重要的血管生成因子：血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)。 VEGF是血管生成开关的主要成分，它作用最强大，可能是最初起始血管生成一系列反应的信号因子，具有以下几种功能：(1)促进内皮细胞的增殖；(2)增加微血管通透性；(3)改变细胞外基质；(4)维持血管生成等作用。JohnSchnorr等报道：在短尾猴的卵巢自体移植的实验中，卵巢移植后实验组每日给予VEGF1ug，对照组不使用VEGF，培养一段时间后发现实验组的激素水平明显高于对照组，其差别有统计学意义。由此推测，VEGF可以促进冷冻移植后的卵巢功能的恢复。 本研究以雌性成熟SD大鼠为研究对象，将其卵巢组织使用玻璃化冷冻方法冷冻保存，复温后作自体异位移植，或把新鲜卵巢组织自体异位移植，然后使用VEGF局部干预，饲养四周后观察卵巢组织形态学和功能方面的情况，初步探讨VEGF在卵巢组织自体移植中的应用价值，评价玻璃化冷冻对卵巢组织形态学和功能的影响；为人类卵巢组织的移植提供参考依据。 材料与方法 1.实验动物健康成熟未交配过的清洁级雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠龄70～80天，体重190～220克。给予标准光照(14h光照、10h黑夜)、室内温度(20±2)℃、湿度40％～50％、标准饲料和水，饲养一周后开始试验。 2.实验方法把40只雌性SD大鼠随机分为以下4组：A组为新鲜卵巢移植组，10只，去势后自体异位移植新鲜卵巢组织；B组为新鲜卵巢移植加用VEGF组，10只，去势后自体异位移植新鲜卵巢组织，并在移植部位给予VEGF局部注射；C组为冷冻卵巢移植组，10只，去势后自体异位移植冻融后的卵巢组织；D组为冷冻卵巢移植加用VEGF组，10只，去势后自体异位移植冻融后的卵巢组织，并在移植部位给予VEGF局部注射。卵巢移植手术后分别饲养四周，取卵巢组织作病理切片，进行形态学观察，同时取大鼠血液，测其雌二醇和孕酮水平，并进行功能方面的评估。 结果 试验过程中共有13只大鼠因麻醉意外、感染等死亡。 1.SD大鼠阴道脱落细胞检查结果新鲜卵巢移植组(A组)：7只SD大鼠中共有6只恢复动情周期，动情周期恢复率为85.7％；新鲜卵巢移植加用VEGF组(B组)：8只SD大鼠全部恢复动情周期，动情周期恢复率为100％；A组：首次动情周期恢复时间为移植后第10.43±2.15，B组：首次动情周期恢复时间为移植后第7.12±2.85天，对两组首次动情周期的恢复时间进行统计学分析，其差异有统计学意义(P＜0.05)。冷冻卵巢移植组(C组)和冷冻卵巢移植加VEGF组(D组)：12只SD大鼠均未恢复动情周期，动情周期恢复率为0。 2.移植4周后SD大鼠雌二醇和孕酮的测定结果新鲜卵巢移植(A组)中SD大鼠的雌二醇(E2)水平(6.64±2.53pg/ml)明显低于新鲜卵巢移植加用VEGF组(B组)中SD大鼠的雌二醇(E2)水平(10.70±3.10pg/ml)，行统计学分析，其差异有统计学意义(P＜0.05)。 新鲜卵巢移植(A组)中SD大鼠的孕酮(P)水平(19.70±5.07ng/ml)明显低于新鲜卵巢移植加用VEGF组(B组)中SD大鼠的孕酮(P)水平(40.56±19.09ng/ml)，行统计学分析，其差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.移植4周后SD大鼠卵巢组织的大体标本观察新鲜卵巢移植(A组)：移植4周后取标本时，发现卵巢组织体积明显增大，移植前卵巢组织体积平均为1.36±0.61mm3，四周后移植物体积平均为13.30±7.19mm3，与周围组织边界清晰，表面可见细小的血管从周围组织中长入卵巢组织中。新鲜卵巢移植加用VEGF组(B组)：移植4周后取标本时，发现卵巢组织体积明显增大，移植前卵巢组织体积平均为1.46±0.49mm3，四周后移植物平均体积为40.04±30.46mm3，表面布满细小的血管，呈鲜红色，从表面偶可见到透明状囊性小卵泡，周围组织血供丰富。比较两组移植物的体积大小，其差别有统计学意义(P＜0.05)。 冷冻卵巢移植组(C组)和冷冻卵巢移植加VEGF组(D组)：移植4周后取标本时，移植部位隐约可见残存的卵巢组织，呈淡红色，未见到明显的血管。 4.组织形态学结果光镜下的组织学观察：A组和B组中，均可见到正常形态的始基卵泡和生长卵泡(初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡和窦卵泡)，偶可见到异常形态的卵泡。A组每10个高倍视野中形态正常的始基卵泡和生长卵泡的平均数目分别为1.14±1.68个和8.14±5.96个，B组的分别为1.38±0.92个和8.63±4.78个，两组间各级正常形态卵泡数目的差异无统计学意义。A组中正常形态的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡所占比例分别为82.14％±23.78％、80.95％±24.40％、84.49％±20.54％、79.29％±17.84％；B组中正常形态的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡所占比例分别为82.29％±20.14％、81.21％±12.82％、81.73％±16.06％、80.21％±18.86％。统计学分析发现各级正常形态卵泡所占的比例在各组之间的差异均没有统计学意义，但是，新鲜卵巢移植组加VEGF组中正常形态的始基卵泡、初级卵泡、窦卵泡所占比例与新鲜卵巢移植组的相比有增高趋势。冷冻卵巢移植组中仅可见到稀疏分布的颗粒细胞，无明显的卵泡生长。 结论 1.使用血管内皮生长因子(VEGF)处理的试验组，移植后卵巢组织的生长情况优于未使用VEGF处理的对照组。VEGF对卵巢功能的恢复有一定的促进作用。 2.自体异位移植卵巢组织的方法具有一定的卵泡存活率，移植后的卵巢功能可以有一定程度的恢复。 3.腹部皮下作为移植部位，既操作方便，又可以减少创伤机会，并且可以清楚观察卵巢组织表面及周围组织的血管生长情况。可以作为建立大鼠卵巢组织移植的动物模型。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢

在读期间撰写的论文