水稻干尖线虫脂肪酸和维生素A结合蛋白基因的克隆和功能研究

摘要

水稻干尖线虫（Aphelenchoides besseyi）是一种迁移性植物地上部寄生线虫、危害多种植物。脂肪酸和维生素A结合蛋白（Fatty acid-and retinol-binding proteins，FAR）是线虫特有蛋白，在线虫营养吸收、调控寄主的组织以及抑制寄主的防卫反应方面具有重要的作用，因此是一种具有应用前景的防治寄生线虫的靶标，近些年受到广泛关注。基因沉默（RNAi）是一种研究植物寄生线虫基因功能的强大工具，在植物寄生线虫RNAi研究中，目前普遍采用浸泡和植物介导的方法，但是两者均存在一些问题，制约其在植物寄生线虫基因功能研究中的应用。因此，根据不同类型植物寄生线虫的生物学特性，研究建立更合理、更简便和更有效的RNAi方法是十分必要的。　　本研究利用实验室已有的水稻干尖线虫2个种群的转录组数据库，分析和筛选得到与脂肪酸和维生素 A 结合蛋白基因相似的转录本序列。利用 RACE 技术，鉴定和扩增了水稻干尖线虫的7个新Ab-far基因，利用生物信息学方法对7个Ab-far基因的结构和特征进行分析；对这些基因进行原核表达，应用荧光光谱测定法对对纯化后的蛋白进行配体结合实验；运用qPCR和原位杂交对7个Ab-far基因在水稻干尖线虫不同虫态的表达量和组织定位进行分析。利用dsRNA浸泡的RNAi技术，测定Ab-far-2和Ab-far-4基因沉默对水稻干尖线虫繁殖力的影响。此外，本研究通过水稻干尖线虫取食真菌的特点，研究建立“真菌介导的 RNAi”方法，并利用该技术研究 Ab-far-1基因在水稻干尖线虫发育和致病中的功能和作用机理。主要获得以下结果：　　1. 鉴定和扩增了水稻干尖线虫的 7 个新 Ab-far 基因（Ab-far-2~Ab-far-8），全长cDNA序列分别为609 bp、847 bp、1109 bp、622 bp、1137 bp、749 bp和609 bp，包含519 bp、501 bp、507 bp、519 bp、555 bp、537 bp和567 bp的开放阅读框，分别编码172、166、168、172、184、178和188个氨基酸；Ab-FAR-2、Ab-FAR-5和Ab-FAR-7具有跨膜结构域；除了Ab-FAR-7之外，其他Ab-FAR蛋白都具有保守酪蛋白激酶 II磷酸化位点，蛋白激酶C磷酸化位点普遍存在于Ab-FAR-2~Ab-FAR-8中；Ab-FAR-2和Ab-FAR-5没有糖基化位点，Ab-FAR-3、Ab-FAR-4、Ab-FAR-6、Ab-FAR-7和Ab-FAR-8均含有1-3个糖基化位点；7个FAR蛋白均含有信号肽结构。　　2. Ab-FAR-3、Ab-FAR-4、Ab-FAR-6、Ab-FAR-7和Ab-FAR-8均能结合脂肪酸和维生素A；Ab-far-2~Ab-far-8基因的拷贝数分别为双拷贝、双拷贝、单拷贝、双拷贝、双拷贝、单拷贝和双拷贝；7个新的Ab-far基因表达位置不同，Ab-far-2 mRNA定位在雄虫的贮精囊，Ab-far-3~Ab-far-5 mRNA表达位置广泛，其中Ab-far-3和Ab-far-5在线虫的神经环也有表达，Ab-far-6和Ab-far-8 mRNA定位在线虫的食道腺，Ab-far-7 mRNA定位在线虫雌虫子宫和后阴子宫囊。7个新的far基因在雌虫、雄虫、幼虫和卵内均有表达，且Ab-far-2、Ab-far-5、Ab-far-7和Ab-far-8在雄虫的表达量最高，Ab-far-4在雌虫中的表达量最高，Ab-far-3和Ab-far-6在卵虫的表达量最高。　　3. 水稻干尖线虫Ab-far-2和Ab-far-4基因经体外dsRNA浸泡处理后，在一定时间范围内，沉默效率随着处理时间的延长而增加。Ab-far-2和Ab-far-4分别被沉默处理24 h和36 h时，目的基因的沉默效率最高；分别被沉默处理36 h时，水稻干尖线虫的繁殖量显著降低（p＜0.05），因此这 2 个 Ab-far 基因在线虫的繁殖过程中发挥重要作用。　　4. 构建了以水稻干尖线虫Ab-far-1为靶基因的RNAi表达载体pBS2-Ab-far-1，并通过根癌农杆菌介导将其导入到灰葡萄菌中。在表达Ab-far-1 dsRNA的转基因灰葡萄孢菌上培养的水稻干尖线虫，其Ab-far-1被有效沉默，对拟南芥（Arabidopsis thaliana）的致病力和在拟南芥上的繁殖受到显著抑制（p＜0.05），并且侵染拟南芥后繁殖的线虫，体内Ab-far-1仍被有效沉默。因此建立的灰葡萄菌介导RNAi能有效沉默靶基因，并且沉默效应持续和可遗传。　　本研究获得了水稻干尖线虫FAR蛋白家族的7个新基因（Ab-far-2~Ab-far-8），这是首次在植物线虫中鉴定多个far基因；Ab-far-2~Ab-far-8种群表达模式和发育表达模式具有多样性，其中有2个Ab-far mRNA在线虫的神经环表达，此前尚未有far在神经环表达的报道，这些结果对筛选水稻干尖线虫防治新靶标基因和建立防治水稻干尖线虫新途径具有重要价值。同时，本研究建立了灰葡萄孢菌介导的线虫RNAi方法，明确了“真菌介导的 RNAi”应用于可取食真菌类植物线虫功能基因研究的可行性和优越性，并首次通过真菌介导的RNAi研究了植物线虫基因功能，为可食真菌类植物寄生线虫的功能基因RNAi提供了新策略和新方法，并为该方法的广泛应用提供了依据、奠定了基础。

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