广东省鸭疫里氏杆菌流行病学调查及携带floR基因的质粒研究

摘要

鸭疫里氏杆菌是种极易感染幼龄鸭、鹅等水禽的革兰氏阴性菌，属黄杆菌属r RN A超家族Ⅴ，目前在世界范围内广泛传播，主要流行于亚洲国家。相较于沙门氏菌及大肠杆菌，鸭疫里氏杆菌血清型较多，目前已发现的有 25 种，对于根据血清型研制相应灭活疫苗造成困难，且野生分离菌株极易对抗生素产生耐药性，因此给水禽养殖行业造成了重大经济损失。目前，关于鸭疫里氏杆菌耐药性的报道虽有不少，但是关于质粒介导的分子传播机制方面研究较少。本文旨在调查近年来广东省鸭疫里氏杆菌野生分离株的流行病学情况并对其耐药原因从质粒介导的分子机制方面进行研究。不仅可以指导广东省鸭疫里氏杆菌感染的临床用药，还可以从分子学角度上追本溯源，控制鸭疫里氏杆菌引起的动物源性疾病的流行。　　2015年8月至2017年6月对广东地区采集到的155份鸭、鹅病料样品进行分离培养，并采用外膜蛋白的特异性PCR的方法进行鉴定，共得到93株鸭疫里氏杆菌，其中鹅源30株，鸭源63株。使用Ⅰ型血清型菌株 RA1对家兔进行免疫，制备Ⅰ型抗血清，并采用平板凝集的方法对本实验室从2007年到2017年现存的220株鸭疫里氏杆菌进行Ⅰ型血清型鉴定，结果表明有119株菌为Ⅰ型血清型，所占比例达54.09%，Ⅰ型血清型菌株为近年来广东地区优势血清型。　　对 93 株鸭疫里氏杆菌采用琼脂二倍稀释法进行药物敏感性试验，结果表明分离株对克林霉素、恩诺沙星等常用药物的耐药性较高，且存在较为严重的多重耐药现象，对头孢西丁、链霉素、阿米卡星、多西环素、四环素、喹乙醇等药物的耐药率较低,而对于对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋均表现为敏感或中介。采用 PCR 的方法对耐药基因进行检测，93株野生分离菌中共检测出17种耐药基因首次在广东地区鸭疫里氏杆菌中检测到aph(3’)-Ⅰa及ermA基因。　　通过SmaI酶对119株Ⅰ型血清型菌株基因组的不同位点进行酶切，并运用PFGE分型技术将菌株根据相似度≥85%分成不同的条带，其中有110株菌成功分型，共得到33种不同的类型，可分为19个簇和14个单一型，结果表明鸭疫里氏杆菌分子型别呈现多样化，不同菌株间同源差异性较大，且存在小范围内的克隆传播。　　采用S1-PFGE和Southern blot的方法对携带floR基因的质粒进行定位，以碱裂解法提取质粒并送去测序，结果表明质粒pRAGD185全长为18982 bp，C+G含量为38.61%。质粒pRAGD185中含有16个假定蛋白，包括2个catB基因、tetX基因、移动蛋白基因、多重 ABC 转运体基因、复制蛋白基因、合成酶基因、floR 基因、lysR基因、ISCR2、IS4351、dhfr基因及三个不知名的假定蛋白基因。

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