广东青枯菌种群结构和4号生理小种YC45菌株的全基因组分析

摘要

由青枯菌侵染引起的作物青枯病是世界范围的毁灭性病害。广东省是作物青枯病发生流行的重灾区，目前对广东青枯菌仅有的研究结果不足以指导作物青枯病防控策略研究及抗青枯病品种选育。本文对广东省作物青枯病发生为害情况进行了调查，研究了广东省不同寄主作物上青枯菌的生物学特性及广东省青枯菌种群结构；测定了分离自具有广东特色的沙姜寄主YC45菌株的全基因组，通过比较基因组学分析了该菌株与其他菌株的基因组差异。本文的主要研究结果如下：　　（1）查明了广东省作物青枯病发生为害情况，明确了15种不同寄主作物青枯病发生的地理分布，分离并保存了15种寄主作物的青枯菌382株。通过病原分离、16S rDNA序列测定及柯赫氏法则验证明确了引起南瓜青枯病、胜红蓟青枯病和广藿香青枯病的病原均为茄科青枯菌；通过生化变种、生理小种、演化型及系统进化分析证明了24个南瓜青枯菌菌株属于青枯菌演化型Ⅰ，1号生理小种，且存在生化变种3和4，序列变种17、45和56；8个胜红蓟青枯菌菌株属于青枯菌演化型Ⅰ，4号生理小种，存在生化变种3，序列变种17、18和45；3个广藿香青枯菌菌株属于演化型Ⅰ，1号生理小种，存在生化变种3，序列变种17和44；，其中序列变种45是中国的首次报道，序列变种 56 是新的序列变种。南瓜青枯病是国际上首次报道，胜红蓟青枯病是我国首次报道，广藿香青枯病是广东省首次系统报道。　　（2）对来自广东省的不同地理起源分离自16种作物的110个青枯菌代表菌株的种群结构特征研究结果显示，1个菌株属于生化变种1，2个菌株属于生化变种2，55个菌株属于生化变种3（占50%）；52个属于生化变种4（47.3%）。110个菌株中108个菌株属于演化型Ⅰ，2个分离自马铃薯的菌株属于演化型Ⅱ。110个菌株分属11个序列变种，分别为序列变种1、13、14、15、17、18、34、44、45、48和57，其中序列变种57为新的序列变种。序列变种15、34和44是广东省分布最广的序列变种，在我省的粤东、粤西、粤北以及中部地区均有发现；序列变种 13、14、17、45 和48只在我省粤西和中部地区发现；序列变种1和18只在我省中部地区出现；序列变种57在我省粤西地区发现；粤东和粤北地区目前只发现序列变种15、34和44。同一寄主的菌株存在多种序列变种类型，从番茄上分离到的青枯菌存在8个序列变种，从马铃薯上分离到的青枯菌存在6个序列变种，从沙姜上分离到的青枯菌存在5个序列变种，从茄子和辣椒上分离到的青枯菌存在4个序列变种，从花生上分离到的青枯菌存在3个序列变种，而从生姜、烟草、空心菜和广藿香上分离到的青枯菌各存在2个序列变种，而从南瓜、菊花、甘薯、胜红蓟、桉树和桑树上分离的青枯菌只存在1种序列变种；相同序列变种的不同青枯菌菌株的致病力不同。　　（3）应用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio测序技术，首次完成分离自沙姜的青枯菌4号生理小种YC45菌株的基因组测定。结果表明，其基因组全长为5,732,909 bp，平均GC含量为67.09%，其中染色体大小3,724,487 bp（GenBank no. CP011997），宏质粒大小2,008,422 bp（GenBank no. CP011998）。其基因组含有6个完整的rRNA操纵子、46个tRNA以及1个ncRNA、2个完整的前噬菌体；编码4,917基因，其中CDS为4,621个，假基因数为243个，移码基因116个，特有基因121个。染色体中共有2192个基因被GO注释，质粒中共有930个基因被GO注释；染色体基因中有2742个蛋白归属于COG家族22个功能类别，宏质粒基因中有1138个蛋白归属于COG家族21个功能类别；共有1454个蛋白参与了6个生物通路。通过基因组比较分析发现，YC45 与同一演化型内的菌株亲缘关系较近，与其它演化型菌株亲缘关系较远；YC45与演化型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的青枯菌菌株的30个毒性因子相关基因以及31个核心Ⅲ型效应子基因存在较大的差异，与同一演化型Ⅰ内的其它青枯菌菌株相比则相对保守。　　（4）利用基因同源重组方法构建青枯菌YC45特异基因ACH51_07235突变体。与 YC45 野生菌株相比，突变体 YC45ΔACH51_07235 菌落明显变小，无流动性，胞外多糖分泌显著减少，生物膜形成量无变化，在NA培养基和Boucher基础培养基中生长速率均升高；突变体对沙姜不致病力。这些结果表明，ACH51_07235基因对青枯菌YC45的生长、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。

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