新城疫病毒与H9N2亚型AIV共感染鸡胚成纤维细胞后病毒复制的动力学研究

摘要

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle diseasevirus， NDV）引起的鸡、火鸡和多种禽类的急性、高度接触性传染病，严重危害禽类。H9N2虽是低致病性禽流感，但可以对禽类造成严重的免疫抑制，增加继发感染其他病原体的可能性。　　ND 与 H9N2 在临床上发病较多，危害较大，二者的混合感染会加重患病禽群的病情，给养禽业带来很大的损失。关于NDV与H9N2亚型AIV共感染的研究较为有限，近年来的研究只是初步探索了二者之间的相互影响情况，而两种病毒共感染的过程和致病机制尚不清楚。本研究旨在建立一个NDV与H9N2亚型AIV共感染的体外细胞模型，比较和分析两种病毒共感染鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF）后，单一感染组与共感染组病毒在 RNA 水平、病毒滴度及相关免疫因子等方面的变化，为研究共感染条件下宿主对病毒的免疫应答和抵抗机制打下基础，为临床防制ND和H9N2混合感染提供新思路和新方向。具体分为4个部分：　　1.本研究参照GenBank上发表及相关文献中的NDV与H9N2亚型AIV的M基因序列设计合成4对引物，以抽提的病毒尿囊液中的cDNA为模板，分别扩增出M基因，将其连接到pMD19-T载体上，筛选出M基因标准阳性质粒，并用q-PCR方法建立标准曲线。　　2.设计NDV与H9N2亚型AIV在CEF细胞上的共感染实验，制作标准曲线分别检测实验组NDV与H9N2亚型AIV的拷贝数。结果表明，在6 h、12 h时，单一感染组的细胞培养物中 M 基因的拷贝数要比共感染组高，病毒复制速度较慢；在24 h、36 h、48 h时，单一感染组的细胞培养物中M基因的拷贝数要比共感染组低，且病毒复制速度较快。由此初步断定：在整个病毒复制内，24 h之前，共感染组中NDV与H9N2亚型AIV互相抑制，24 h之后，二者相互促进对方在CEF细胞内的复制。　　3.利用细胞免疫组化技术（immunohistochemical，ICC）分别测定实验组中NDV与H9N2亚型AIV的增殖曲线。结果显示，在整个复制周期内，单一感染NDV组的病毒滴度要高于混合感染组，而单一感染H9N2亚型AIV组的病毒滴度要低于混合感染组，说明在发生共感染时， H9N2亚型AIV会抑制NDV在CEF细胞内的复制，而NDV会促进H9N2亚型AIV在CEF细胞内的复制。　　4. 利用q-PCR测定了6个固有免疫相关因子IFN-α、IFN-β、IL18、IL-1β、TLR4、及NLRC5的表达，对比分析其表达情况。IFN-α、 IFN-β基因有早期阶段的表达抑制，共感染后期，二者均呈现上调；IL-1β基因在整个共感染阶段都呈现上调；IL18、TLR4与NLRC5基因在早期阶段没有明显的表达变化，共感染后期均呈现上调。结果表明，在NDV与H9N2亚型AIV共感染CEF细胞24 h后，二者互相促进对方的复制并共同作用于CEF细胞，加重了对CEF细胞的感染力。

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