尼瓦拉野生稻内生菌多样性及促生作用

摘要

植物促生菌不仅可以合成植物生长发育方面所需要的生长活性物质，改善土壤理化性质，通过固氮、溶磷、解钾、产铁载体等作用直接促进植物的生长，而且还可以通过繁殖竞争生存空间和营养资源抑其他病原微生物的生长，阻碍植物病害的发生。本研究以尼瓦拉野生稻为试验材料，采用DN和NFB两种无氮培养基对内生菌进行分离纯化。利用IS-PCR插入序列指纹图谱技术与16S rRNA基因序列分析技术相结合的方法，确定尼瓦拉野生稻植物内生菌的系统发育进化关系；采用Salkowski比色法定、钼锑抗比色法、原子吸收分光光度计法、络天氰法，测其产生长素、溶磷、解钾、产铁载体的促生能力。最后检测细菌的生理生化特性及对pH、抗生素、NaCl的耐受性。　　（1）本研究以DN和NFB两种无氮培养基从尼瓦拉野生稻中筛选获得113株内生细菌，利用IS-PCR插入序列指纹图谱聚类成21个类群，通过16S rRNA基因序列分析发现内生菌涉及于Bacillus siamensis、Bacillus tequilensis、Klebsiella singaporensis、Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae 、 Burkholderia contaminans 、Ochrobactrum haematophilum、Klebsiella michiganensis、Burkholderia vietnamiensis、Enterobacter ludwigii、Citrobacter bitternis、Pseudomonas beteli、Ralstonia pickettii、Herbaspirillum seropedicae、Raoultella ornithinolytica、Enterobacter cloacae subsp. dissolvens、Patulibacter americanus、Humibacter aquilariae、Achromobacter insuavis、Achromobacter xylosoxidans、Bacillus toyonensis、Bacillus licheniformis。表明尼瓦拉野生稻内生细菌具有丰富的遗传和物种多样性。　　（2）尼瓦拉野生稻中共分离出113株内生菌，其中有97株细菌能产生生长素，产生长素的含量分布在1.28～34.97 mg/L范围内，其中有10株产生长素能力突出，分别是细菌kq1、kq3、oh3、km1、en2、en3、cs3、hs1、ro6和bt2，测得相应产生长素的含量分别为31.25 mg/L、32.46 mg/L、32.27 mg/L、30.06 mg/L、31.06 mg/L、32.36 mg/L、32.78 mg/L、34.97 mg/L、35.25 mg/L和44.96 mg/L；其中有90株内生固氮菌，固氮酶活性分布在7.85～618.13 nmol/(mL?h) 范围内，其中有7株固氮菌得固氮酶活性较高，细菌分别为oh3、bv1、cs3、cs4、hs1、ro2和ro6，测得相对应的固氮酶活性分别为 618.13 nmol/(mL?h)、571.28 nmol/(mL?h)、387.61 nmol/(mL?h)、373.01 nmol/(mL?h)、403.16 nmol/(mL?h)、362.17 nmol/(mL?h) 和463.24 nmol/(mL?h)；其中有64株菌溶磷菌，溶磷效果分布在5.79～73.81 mg/L范围内，有10株溶磷菌的溶磷效果较好，细菌分别是ks3、ks5、oh3、bv1、cs3、cs4、rp2、ro1、ro6和ec1，测得相对应的细菌发酵液中可溶性磷的含量分别是40.22 mg/L、46.42 mg/L、56.72 mg/L、55.34 mg/L、67.8 mg/L、43.01 mg/L、51.78 mg/L、43.55 mg/L、73.81 mg/L和43.29 mg/L；其中有65株解钾菌，解钾效果分布在2.29～97.24 mg/L范围内，其中有8株优势解钾菌分别为oh3、bv1、cs1、cs3、hs1、hs2、ro1和ro6，测得相对应细菌的发酵液中可溶性钾的含量分别为97.2 mg/L、86.43 mg/L、50.31 mg/L、88.52 mg/L、72.27 mg/L、56.27 mg/L、53.04 mg/L、80.04 mg/L；其中有102株菌能产生铁载体，并且铁载体颜色呈现出紫色、红色、粉红色三种。以上实验数据表明尼瓦拉野生稻内生细菌具有丰富的功能多样性。　　（3）通过细菌促生功能试验数据综合评价分析，从中筛选得4株具有高效促生长能力的细菌，分别为oh3、ro6、bv1和cs3。将优势细菌接种生菜后，生菜的株高显著增加了38.14%～87.51%，生菜的叶长显著增加了77.01%～128.00%，生菜鲜重显著增加了52.08%～128.66%，生菜干重显著增加97.48%～275.58%，生菜地下根重显著增加了14.96%～73.32%。表明4株细菌具有作为微生物肥料的菌种资源潜质。

目录

第一个书签之前

1 前 言

1.1植物内生细菌的概述

1.2.1纯培养技术

1.2.2非培养技术

1.3植物内生细菌的生物学作用

1.3.1解钾作用

1.3.2溶磷作用

1.3.3固氮作用

1.3.4产生理活性物质

1.3.5对植物病虫害的控制作用

1.3.6提高植物抗逆性

1.4 微生物在农业上的应用

1.4.1微生物饲料

1.4.2微生物肥料

1.4.3微生物农药

1.4.4微生物食品

1.4.5微生物在农业环保中的应用

1.5研究意义与目的

1.6技术路线

2 材料与方法

2.1植物内生细菌的分离纯化

2.1.2培养基

2.1.3植物内生菌的分离纯化

2.2细菌形态学鉴定

2.2.1实验所需试剂

2.2.2菌种的准备

2.2.3形态学观察

2.3植物内生菌IS-PCR指纹图谱菌类分析

2.3.1植物内生菌DNA的提取

2.3.2 IS-PCR指纹图谱菌类分析

2.4植物内生菌多样性分析

2.4.1植物内生细菌16S rRNA基因扩增

2.4.2 植物内生细菌16S rRNA基因测序与同源性分析

2.5 植物内生细菌生理生化的测定

2.6植物内生细菌促生能力的测定

2.6.2植物内生细菌固氮能力的测定

2.6.3植物内生细菌溶磷能力的测定

2.6.4植物内生细菌解钾能力的测定

2.6.5植物内生细菌产铁载体能力测定

2.6.6尼瓦拉野生稻高效促生菌生菜促生实验

2.6.7促生功能菌细菌对不同抗生素、NaCl浓度和pH耐受性

3.1尼瓦拉野生稻植物内生细菌的分离和纯化

3.2尼瓦拉野生稻植物内生细菌的聚类分析

3.3各类群代表细菌16S rRNA基因序列相似性分析

3.4植物内生细菌生理生化能力的测定

3.5植物内生菌促生能力的测定

3.5.1植物内生菌产生长素能力的测定

3.5.2植物内生菌固氮酶活性的测定

3.5.3植物内生菌溶磷能力的测定

3.5.4植物内生菌解钾能力的测定

3.5.5尼瓦拉野生稻内生细菌产铁载体能力测定

3.5.6尼瓦拉野生高效内生菌的促生效果

3.6植物内生菌细菌对不同抗生素、NaCl浓度和pH耐受性

3.6.1植物内生菌细菌对不同抗生素能力的测定

3.6.2植物内生菌细菌对不同NaCl浓度耐受性

3.6.3植物内生菌对不同pH耐受性

4 讨论

4.1野生稻内生细菌物种多样性

4.2野生稻内生细菌的遗传多样性

4.3野生稻内生细菌的促生功能多样性

5结论

参 考 文 献

附 录

附录A学习期间研究成果

附录B 部分产生长素菌株定性测定结果