T-2毒素经miR-449a/SIRT1/PGC-1α通路诱导动物细胞线粒体生物合成

摘要

T-2毒素是由镰刀菌（Fusarium）产生的一种单端孢霉烯类毒素，分布广泛且毒性强，这给全世界范围内的畜禽饲养及人类健康带来了极大的威胁。T-2 毒素进入动物细胞后除了影响核糖体之外，还会引起线粒体功能紊乱并产生大量活性氧（ROS），最终导致细胞凋亡。研究T-2毒素毒理机制的过程中，我们观察到低浓度的T-2毒素短时间处理细胞后会增加线粒体的生物合成并提高线粒体功能。通过分析与线粒体生物合成相关基因在T-2毒素诱导下的表达量，找出在mRNA和蛋白水平都发生上调的基因，然后敲降和过表达该基因并验证其是否参与T-2毒素对线粒体生物合成的调控；之后从该基因表达量发生上调是如何受到T-2毒素调控的角度出发，分别从转录因子和miRNA参与调控基因的机制入手，最终阐明它们是如何影响T-2毒素对相关基因的诱导表达，从而找出参与T-2毒素诱导线粒体生物合成的通路。　　低浓度的T-2毒素处理人胚胎肾细胞HEK293T，人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa后，发现三种细胞内线粒体数目显著增多，线粒体mass增强，线粒体DNA （mtDNA）拷贝数上升，细胞产生的ROS和ATP含量增加。RT-qPCR检测与线粒体生物合成相关基因mRNA水平后得出SIRT1和TFAM在T-2毒素处理后的以上三种细胞中均发生明显上调，Western blot检测SIRT1和TFAM后发现两者的蛋白表达量仅在HEK293T和HepG2细胞中显著增多。　　PGC-1α是SIRT1下游的靶基因，它的蛋白活性跟其翻译后修饰的状态密切相关，在HEK293T，HepG2和HeLa细胞中检测T-2毒素诱导下PGC-1α蛋白水平后发现三种细胞中 PGC-1α 表达量都没有明显变化。PGC-1α 翻译后修饰主要包括磷酸化和乙酰化，而SIRT1又是一个去乙酰化酶，所以在后续试验中主要分析PGC-1α乙酰化水平。免疫共沉淀（IP）检测得出仅在T-2毒素诱导后的HEK293T和HepG2细胞中发现PGC-1α乙酰化水平显著下调，而在SIRT1敲降的HEK293T和HepG2细胞中并未观察到这个现象。　　在SIRT1敲降和过表达的HEK293T和HepG2细胞中检测到SIRT1表达量与线粒体生物合成呈正相关。T-2毒素处理SIRT1敲降的细胞后发现mtDNA拷贝数相比对照组没有明显上调，可以得出SIRT1参与了T-2毒素对线粒体生物合成的调控。由此我们提出SIRT1的存在是否会延缓T-2毒素对细胞的损伤。在SIRT1敲降的细胞中添加T-2毒素处理，经MTT检测后发现T-2毒素作用下敲降组细胞的存活率明显低于对照组，这个结果说明两种细胞在T-2毒素处理下的自我保护依赖于SIRT1的过量表达。　　SIRT1蛋白表达量的上调是T-2毒素调控线粒体合成的主要原因，而T-2毒素是如何诱导SIRT1蛋白水平发生上调并不清楚。为揭示T-2毒素调控SIRT1的机制我们分别从转录水平和后转录水平两个方面进行探讨，首先构建含有SIRT1启动子的双荧光素酶载体，在分析双荧光素酶活性并确定调控SIRT1本底表达的启动子区域后，添加T-2毒素处理细胞并检测SIRT1启动子的双荧光素酶活性，发现诱导组相比于对照组没有显著变化，可以得出T-2毒素对SIRT1的诱导并不是通过调控它的启动子区域来完成。之后分析了miRNAs是否会参与该调控过程，首先在miRNAs预测网站获得与SIRT1 3'UTR相关的miRNAs，然后通过RT-qPCR检测T-2毒素处理后的HEK293T和HepG2细胞发现miR-449a和SIRT1的表达量呈负相关。T-2毒素处理miR-449a过表达的细胞后检测到SIRT1蛋白水平及mtDNA拷贝数相比T-2毒素处理的对照组细胞没有升高，同时IP和MTT试验也证实了在miR-449a过表达的细胞中添加T-2毒素诱导会降低PGC-1α活性和细胞存活率，这些数据表明miR-449a在T-2毒素调控线粒体合成过程中发挥着重要作用。　　综上所述，我们发现低浓度T-2毒素处理动物细胞后会引起线粒体生物合成增加及功能增强并首次提出SIRT1参与T-2毒素对线粒体生物合成的调控。同时T-2毒素可以通过抑制miR-449a的表达来上调SIRT1，而SIRT1表达量上调又可引起PGC-1α发生去乙酰化从而增加其活性，PGC-1α 被激活后又引发了线粒体生物合成增加。由此我们得出miR-449a/SIRT1/PGC-1α通路调控了T-2毒素诱导动物细胞线粒体生物合成增加的过程，这给进一步研究T-2毒素在不同浓度下作用于动物细胞会产生不同影响的分子机制提供了一个可靠的参考。

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第1章 前言

1.1 研究背景

1.1.1 T-2毒素的代谢及毒性

1.1.2 动物细胞线粒体的生物合成及对T-2毒素的响应

1.1.3 SIRT1和PGC-1α在线粒体生物合成过程中的作用

1.1.4 TFAM调控mtDNA拷贝数

1.1.5 转录因子调控基因的表达

1.1.6 miRNA调控基因的表达及线粒体的生物合成

1.2 研究目的与意义

1.3 研究技术路线

第2章 T-2毒素的细胞毒性及对动物细胞线粒体的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.2 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 MTT比色法检测T-2毒素的细胞毒性

2.3.2 透射电镜观察T-2毒素处理细胞后线粒体的数目和形态

2.3.3 RT-qPCR检测mtDNA的拷贝数

2.3.4 线粒体mass的检测

2.3.5细胞ROS含量的检测

2.3.6 线粒体超氧化物含量的分析

2.3.7 线粒体膜电位的检测

2.3.8 分析T-2毒素处理后细胞内ATP含量

2.4 小结

第3章 T-2毒素诱导SIRT1表达上调及PGC-1α去乙酰化

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 T-2毒素处理细胞后检测与线粒体合成相关基因mRNA的表达

3.3.2 TFAM、PGC-1α和SIRT1在T-2毒素诱导下的蛋白表达变化

3.3.3 T-2毒素影响PGC-1α的乙酰化水平

3.4 小结

第4章 T-2毒素诱导动物细胞线粒体合成依赖SIRT1

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.2.2.1 Stbl3感受态细胞的制备

4.3 结果与分析

4.3.1 HepG2和HEK293T细胞中获得过表达SIRT1稳定的细胞株

4.3.2 HepG2和HEK293T细胞中获得SIRT1敲降的稳定细胞株

4.3.3 过表达SIRT1或敲降SIRT1后检测mtDNA拷贝数

4.3.4 SIRT1过表达对PGC-1α的影响

4.3.5 SIRT1敲降对PGC-1α的影响

4.3.6 T-2毒素处理SIRT1敲降细胞株后检测PGC-1α乙酰化水平变化

4.3.7 TFAM敲降后mtDNA拷贝数的变化

4.3.8 SIRT1和TFAM参与T-2毒素对mtDNA拷贝数的调控

4.3.9 SIRT1正调控TFAM的表达

4.3.10 T-2毒素处理SIRT1过表达稳定细胞株后mtDNA拷贝数变化

4.3.11 T-2毒素处理SIRT1敲降稳定细胞株后细胞ROS产量的变化

4.3.12 T-2毒素处理SIRT1敲降的稳定细胞株后MTT检测细胞存活率

4.3.13 抗氧化剂预处理细胞后检测T-2毒素处理下线粒体mass变化

4.4 小结

第5章T-2毒素通过调控miRNA来上调SIRT1表达

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.3 结果与分析

5.3.1 双荧光素酶报告系统检测SIRT1启动子活性

5.3.2 T-2毒素处理HepG2和HEK293T细胞后检测miRNA表达水平的变化

5.3.3 miR-449a和miR-181d过表达对SIRT1蛋白表达的影响

5.3.4 双荧光素酶系统验证SIRT1是miR-449a的靶基因

5.3.5 DICER参与调控SIRT1的表达

5.3.6 miR-449a参与T-2毒素对SIRT1的调控

5.3.7 miR-449a参与T-2毒素对PGC-1α乙酰化的调控

5.3.8 miR-449a参与T-2毒素对mtDNA的调控

5.3.9 T-2毒素处理miR-449a过表达的细胞后MTT检测细胞存活率

5.4 小结

第6章 全文讨论与结论

6.1 全文讨论

6.1.1 T-2毒素对真核细胞线粒体生物合成和功能的影响

6.1.2 SIRT1和PGC-1α在T-2毒素调控线粒体功能过程中发挥重要作用

6.1.3 miR-449a参与T-2毒素对SIRT1的表达调控

6.1.4 线粒体生物合成及发挥功能过程中miRNA和ROS的作用

6.2 创新之处

6.3 全文结论

致 谢

参考文献

附 录