检测伪狂犬病毒抗体及病原的免疫层析试纸条的研制

摘要

近年来，猪伪狂犬病在国内许多猪场再次广泛流行，给我国养猪业造成了巨大危害，因此研制简便、快速、灵敏、特异的检测方法对该病的快速检测及抗体的检测具有重要的应用价值。本研究利用烧制的金纳米材料，分别研制了简便、快速、灵敏、特异的检测伪狂犬病毒抗体和抗原的胶体金免疫层析试纸条，以用于伪狂犬病毒抗体的检测和临床病料中伪狂犬病毒的检测。具体研究内容如下：　　1. 检测伪狂犬病毒抗体的免疫层析试纸条的研制，此检测系统采用间接法。用蔗糖密度梯度离心法纯化伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），结果在30%、40%和50%蔗糖梯度处各有一个条带。将纯化的各个条带经PCR和ELISA检测发现其均含有病毒粒子且特异性良好，通过BCA对其浓度进行测定，结果表明40%蔗糖条带处的浓度最高，因此选取 40%的条带层病毒与生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Biotin-N-hydroxysuccinimide ester，BNHS）结合形成BNHS-PRV复合物，并将该复合物标记于烧制的胶体金颗粒上；将金黄色葡萄球菌A蛋白（StapHylococcus A protein， SPA）包被于NC膜的检测线（Test line，T线）上，链酶亲和素（Streptavidin，SA）包被于质控线（Control line，C线）上，并对反应系统经过一系列条件优化，主要包括样品垫、喷金量、BNHS-PRV复合物标记量、SPA包被浓度和血清稀释倍数等；将其在综合优化的条件下组装成试纸条，对其特异性进行检测，结果表明该试纸条与PCV-2、CSFV、PRRSV和FMDV阳性血清无交叉反应，特异性良好。用此试纸条对175份临床猪血清进行检测，并与商品化gB-ELISA试剂盒检测结果进行比较，结果表明二者的阳性符合率93.9%，阴性符合率83.3%，总符合率91.4%。　　2. 检测伪狂犬病毒病原的免疫层析试纸条的研制，此检测系统采用双抗体夹心法。首先将PRV gB单抗标记于烧制的胶体金颗粒上并喷于结合垫上，然后将PRV gB单抗包被于NC膜的检测线（Test line，T线）上，羊抗鼠IgG包被于质控线（Control line， C线）上，通过对标记pH、样品垫、PRV gB单抗包被浓度、喷金量和PRV gB单抗标记量进行一系列的优化后组装成胶体金层析试纸条，并对其特异性和灵敏度进行检测，结果表明该试纸条与PEDV、PCV-2、CSFV、PRRSV和TGEV 病毒均无交叉反应，试纸条的灵敏度可达 4.375×104.5TCID50。用此试纸条对 21 份疑似伪狂犬病临床病料进行检测，并与gE PCR检测结果进行比较，结果表明二者的阳性符合率为84.6%，阴性符合率为87.5%，总符合率为85.7%。　　本研究初步建立了一种适用于现场快速检测血清中伪狂犬病抗体的胶体金免疫层析试纸条方法，可对伪狂犬病毒抗体的检测；基于双抗体夹心法初步建立了一种适用于快速检测伪狂犬病毒的胶体金免疫层析试纸条方法，可用于伪狂犬病毒的现场快速检测。

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