H9N2亚型AIV对NDV致病性的影响及鸡SOCS3蛋白在NDV感染中的作用研究

摘要

禽流感（Avian Influenza, AI）和新城疫（Newcastle Disease, ND）分别是由禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的，是危害家禽养殖业两大最主要的烈性传染病，可引起家禽 100%发病和死亡，被世界动物卫生组织（Office InternationalDes Epizooties,OIE）和我国农业部分别列为法定报告疫病和一类传染病。广东省地处我国东南沿海，拥有温暖湿润的气候、大面积的湿地、发达的养殖业和大量的活禽交易市场，这些因素为病毒的传播提供了有利的条件。为了控制AI和ND的发生，我们采取了密集的免疫措施，但AI和ND仍然偶有发生。为了及时了解危害我国广东省家禽养殖业AIV和NDV的流行情况，我们在广东省收集疑似AIV和NDV感染家禽的组织病料，进行病毒分离鉴定，并研究代表毒株对其易感宿主SPF鸡的致病性和传播特性。　　本研究中，从广东省各地区收集疑似AIV和NDV感染家禽的组织病料，共分离鉴定13株H5N6亚型高致病性AIVs（High pathogenicity AIVs,HPAIVs）、6株H7N9亚型HPAIVs、8株NDV强毒（5株VIId亚型、2株VI型和1株基因XII型）和2株H9N2亚型低致病性AIVs。值得注意的是，2份来源于鸡的组织病料中，既可检测到基因VIId亚型NDV又可检测到H9N2亚型AIV，表明在我国广东省鸡群中，存在基因 VIId 亚型 NDV 与 H9N2 亚型 AIV 混合感染的现象。为了研究 H5N6 与 H7N9 HPAIV对易感宿主SPF鸡的致病性和传播特性，选取H5N6毒株QY01和H7N9毒株Z1，对SPF鸡以106EID50感染剂量通过滴鼻途径进行攻毒，攻毒12 h后，各组中再放入3只健康SPF鸡作为同居对照组。结果表明，H5N6与H7N9 亚型HPAIV均可使感染组和同居组中SPF鸡100%发病死亡，MDT分别为2.25和4 d，且可在SPF鸡体内广泛复制。　　为了研究H9N2亚型AIV与基因VIId亚型NDV强毒（velogenic NDV,vNDV）混合感染对SPF鸡致病性的影响，本研究选取当前H9N2亚型AIV流行毒株和vNDV （rGM株）进行混合感染实验。试验结果表明，H9N2和vNDV同时感染不会影响SPF鸡的死亡率，但可延迟感染鸡发病，vNDV感染后3 d，vNDV在SPF鸡体内的复制水平降低；先感染H9N2后再感染vNDV，SPF鸡的死亡率明显增加，vNDV感染后3 d，vNDV在SPF鸡体内的复制水平增高。以上结果表明，H9N2亚型AIV与vNDV同时感染，可延缓 vNDV 的复制从而延缓感染鸡的发病死亡；先感染 H9N2 后感染vNDV，可加快vNDV的复制从而加剧感染鸡感染发病。　　为了深入分析H9N2亚型AIV与vNDV混合感染影响对SPF鸡致病性的作用机制，我们选取H9N2亚型AIV与vNDV株共同的靶器官肺脏进行转录组学的研究。结果表明：与vNDV单独感染组比较，H9N2亚型AIV与vNDV同时感染组中的差异基因（Differential expression genes,DEGs）主要集中在细胞生长发育和细胞代谢等过程；先感染H9N2亚型AIV后感染vNDV组的DEGs主要集中在宿主免疫应答的过程，并表现出下调。随后我们选择抗病毒相关基因，通过qRT-PCR进行验证，结果与RNA-seq的趋势一致。以上结果表明，H9N2亚型AIV与vNDV同时感染时，在感染的早期2 者可能竞争能量以及其他复制所需原材料，从而造成 H9N2 亚型AIV 延缓vNDV的复制；先感染H9N2亚型AIV后感染vNDV，H9N2亚型AIV可压制宿主免疫反应，尤其是抗病毒反应，从而加速vNDV的复制进而加剧感染鸡发病死亡。　　转录组学分析显示，vNDV感染SPF鸡的肺脏中，细胞因子信号转导抑制因子3 （Suppressor of cytokines signaling 3,SOCS3）的mRNA表达量显著增加。SOCS3分子是免疫反应中一种负调控蛋白，可抑制多种免疫分子过度表达，在宿主的免疫应答过程中具有重要作用。研究发现，多种病原微生物可利用 SOCS3 蛋白拮抗宿主干扰素抗病毒反应。针对NDV逃逸宿主天然免疫反应的机制尚不清楚这一问题，结合最新研究进展，本研究通过过表达、siRNA 干扰和抑制剂等技术手段进一步探索了鸡SOCS3蛋白在NDV感染过程中的作用。结果显示，NDV体外感染可诱导SOCS3蛋白的表达，这一过程依赖病毒复制；NDV感染NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理的DF-1细胞，可观察到SOCS3蛋白的表达明显受到抑制，表明NF-κB信号通路介导了NDV感染诱导SOCS3蛋白表达的过程。在DF-1细胞中过表达和siRNA抑制SOCS3蛋白的表达后，可明显观察到NDV的复制受到影响。NDV感染siRNA干扰SOCS3基因表达的DF-1细胞后，干扰素刺激因子（Interferon Stimulated Gene,ISGs）如Mx1、Viperin和IFIT5的表达量明显增加，表明NDV可通过诱导SOCS3蛋白的表达调控ISGs的表达。　　综上所述，当前危害广东省家禽养殖的AIV和NDV分别为H5N6与H7N9亚型HPAIV及VIId亚型NDV，并发现自然条件下H9N2亚型AIV可与VIId亚型NDV在鸡群中发生混合感染。发现H9N2亚型AIV与NDV同时感染，在感染的早期可能通过竞争复制原材料造成病毒的拮抗作用；先感染H9N2亚型AIV后感染NDV，H9N2亚型AIV可通过抑制宿主免疫反应加剧NDV感染发病。另外，我们还探索了SOCS3蛋白在NDV感染过程中的作用，证实NDV感染可通过NF-κB信号通路诱导SOCS3蛋白的表达拮抗宿主的干扰素抗病毒反应，丰富了NDV逃逸宿主免疫反应的分子机制。

目录

第一个书签之前